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引物的合成及純化方式2022/10/24

目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺y三酯法。該方法具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。主要是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成，由待合成引物的3'端向5'端合成延伸，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。固相亞磷酰胺三酯法合成引物的具體步驟如下：1)用三lv乙酸去除固相載體5'-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5'-羥基；2)將亞磷酰胺保護核苷酸單體與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，與游離的5'-羥基發生縮合反應；3)由于無法*的5'-羥基都參與縮合，可能有極

詳細解答逆轉錄操作過程中問題2022/10/17

逆轉錄（reversetranscription）是以RNA為模板合成DNA的過程，即RNA指導下的DNA合成。在實際的操作過程中，還會有各種問題，現做詳細解答！1.如何提高RT-PCR反應的靈敏度與特異性？①確定模板RNA完整性好，無DNA污染。②RNA模板中不應含有擴增反應抑制劑。③使用適量的模板RNA，模板量太多會降低特異性，太少會導致擴增不出條帶或條帶太弱。④若模板中有二級結構，可通過提高逆轉錄反應溫度來提高擴增效果。2.RNA中含有逆轉錄抑制劑時，怎么處理？逆轉錄抑制劑包括：SDS、E

ELISA標本的處理與注意事項2022/10/10

ELISA是酶聯接免疫吸附劑測定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發展起來的一種免疫酶技術。ELISA的檢測目的是為了實驗提供準確的實驗依據，為了保證實驗數據的可靠性，在實驗過程中必須堅持全面的質量控制和全過程質量控制，在收集標本前都必須有一個完整的計劃。ELISA標本的處理：1、血清：室溫血液私人凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。2.血漿：應

詳述ELISA定性測定判斷方法2022/10/05

ELISA定性測定的結果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出"有"或"無"的簡單回答，分別用"陽性"、"陰性"表示。"陽性"表示該標本在該測定系統中有反應。"陰性"則為無反應。用定性判斷法也可得到半定量結果，即用滴度來表示反應的強度，其實質仍是一個定性試驗。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的稀釋度即為滴度。根據滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性具定量意義。在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在

細胞衰老檢測方法與步驟2022/09/26

細胞衰老是細胞在正常環境條件下發生的功能減退、逐漸趨向死亡的現象。衰老的細胞表現為細胞體積變大，呈扁平狀；細胞核變大，核膜內陷，染色質聚集、固縮、裂解；胞質內顆粒增加，有空泡形成；線粒體的數目及形狀發生改變；膜流動性降低；溶酶體內容物增多，導致溶酶體酶β-半乳糖苷酶活性升高。衰老細胞所具有的上述特征成為各種細胞衰老檢測手段的依據。細胞衰老檢測方法與步驟:（1）細胞接種前在6孔培養板中預先放置滅菌的細胞片，每孔加入1×10E5個細胞，37℃5%CO2條件下培養過夜，使細胞在細胞片上生長。（2）在超

抗體的功能用途2022/09/19

抗體（英語：antibody）：病原體侵入人體后，刺激了淋巴細胞，淋巴細胞就會產生一種抵抗該病原體的特殊蛋白質，叫作抗體。（免疫球蛋白不僅僅只是抗體）是一種由漿細胞（效應B細胞）分泌，被免疫系統用來鑒別與中和外來物質如細菌、病毒等的大型Y形蛋白質，僅被發現存在于脊椎動物的血液等體液中，及其B細胞的細胞膜表面?？贵w能識別特定外來物的一個du特特征，該外來目標被稱為抗原。一、抗體的功能抗體的主要功能是與抗原（包括外來的和自身的）相結合，從而有效地清除侵入機體內的微生物、寄生蟲等異物，抗體（antib

細胞遷移步驟實驗方法2022/09/13

細胞遷移即細胞劃痕法，是測定細胞遷移運動與修復能力的方法，類似體外傷口愈合模型。在體外培養皿或平板培養的單層貼壁細胞上，用微量槍頭或其他硬物在細胞生長的中央區域劃線，去除中央部分的細胞，然后繼續培養細胞至實驗設定的時間，取出細胞培養板，觀察周邊細胞是否生長至中央劃痕區，以此判斷細胞的生長遷移能力，實驗通常需設定正常對照組和實驗組，實驗組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等組別，通過不同分組之間的細胞對于劃痕區的修復能力，可以判斷各組細胞的遷移與修復能力。當細胞長到融合成單層狀態時，在融合的單層

ELISA實驗加樣注意點2022/09/05

ELISA實驗加樣注意點如下：1、標本為血清：最好將血液先自然存放1-2小時后，再用3000rmp離心15分鐘;標本為血漿：必須使用含抗凝劑的血液標本收集管，采血后必須立即顛倒采血管混合5-10次，放置一段時間后，3000rpm離心15分鐘;若在幾天內檢測，可放在2-8℃冰箱中，若要貯存，則置于-20℃的低溫冰箱內。2、加樣后及時放入孵箱。3、加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干。4、如果采用AT或其他全自動加樣，最好選擇FAME或其他后處理儀器加酶試劑。5、標本較多時，請分批操作。6、血清樣

抗原的兩種特性分享2022/08/30

抗原（antigen），是指能夠刺激機體產生（特異性）免疫應答，并能與免疫應答產物抗體和致敏淋巴細胞在體內外結合，發生免疫效應（特異性反應）的物質。抗原的基本性質具有異物性、大分子性和特異性。異物性是指進入機體組織內的抗原物質，必須與該機體組織細胞的成分不相同。抗原的特性：根據抗原的概念可以看出抗原有兩種特性1、免疫原性（immunogenicity）即抗原刺激機體免疫系統產生免疫應答的過程。該過程包括：抗原進入機體后，刺激淋巴細胞活化、增殖、分化，產生抗體或致敏的效應淋巴細胞。2、反應原性（r

介紹選擇流式抗體技巧2022/08/22

流式抗體本身也是抗體，所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇最基本的條件：目標蛋白特異性，反應種屬以及應用實驗。流式抗體能夠在短時間內檢測分析或分選大量細胞，在血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學等領域中的應用越來越廣泛。其純度、批次穩定性、特異性，以及流式結果的可重復性備受重視。流式抗體熒光標記的方式包括直接標記和間接標記兩種。在流式實驗過程中，盡量減少實驗工序和過程，以保證實驗的真實和準確性。因此在條件允許的范圍內，建議盡量用直接標記的抗體進行實驗而不去做間接標記。隨著流式細胞術的日益發展，流式抗體及

移液器的使用方法及注意事項2022/08/15

介紹下可調式自動取液器的具體操作方法：用拇指和食指旋轉取液器上部的旋鈕，使數字窗口出現所需容量體積的數字，在取液器下端插上一個塑料吸頭，并旋緊以保證氣密，然后四指并攏握住取液器上部，用拇指按住柱塞桿頂端的按鈕，向下按到第一停點，將取液器的吸頭插入待取的溶液中，緩慢松開按鈕，吸上液體，并停留1～2秒鐘。移液器的使用方法：1.設定移液體積：從大量程調節至小量程為正常調節方法，逆時針旋轉刻度即可；從小量程調節至大量程時，應先調至超過設定體積刻度，再回調至設定體積，這樣可以保證移液器的精確度。2.裝配移

解析逆轉錄實驗中操作問題2022/08/01

逆轉錄（reversetranscription）實驗作為是常見的分子生物學實驗之一，逆轉錄是以RNA為模板合成DNA的過程，即RNA指導下的DNA合成，逆轉錄實驗包括3大要素，分別是引物、逆轉錄酶和RNA模板。雖然看上去步驟簡單，但是逆轉錄實驗中實際操作時常出現問題如下：1.如何提高RT-PCR反應的靈敏度與特異性？①確定模板RNA完整性好，無DNA污染。②RNA模板中不應含有擴增反應抑制劑。③使用適量的模板RNA，模板量太多會降低特異性，太少會導致擴增不出條帶或條帶太弱。④若模板中有二級結構

IHC常用酶標二抗原理及特點2022/07/25

免疫組化（IHC）是利用抗原與抗體的特異性結合原理和特殊的標記技術，通過化學反應使標記抗體顯色，對組織細胞內的特異性抗原進行定位、定性、定量檢測的一門技術。本文主要總結二抗原理及其特點，以提供更好的選擇。IHC常用酶標二抗原理圖1.SABC法原理：SABC法是利用鏈酶親和素(Streptavidin)與生物素(Biotin)*的高度親和力這一生物學性質，先將生物素與辣根過氧化物酶(HRP)結合，形成生物素化HRP，然后與鏈酶親和素按一定比例混合，形成SABC復合物。用生物素化二抗與第一抗體結合，

詳解PCR反應條件的選擇2022/07/18

PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。溫度與時間的設置：基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性）。1、變性溫度與時

ELISA組織樣本處理方法2022/07/05

用ELISA進行檢測的樣本類型包括常見的血液（血清、血漿），組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養上清以及不常見的皮膚組織、尿液、糞便、肺泡灌洗液、唾液、腦脊液、胸腹水、前列腺液、精液、陰道分泌物等，這些樣本收集的時間、處理方法和保存都會影響到ELISA實驗的結果。下面就常見ELISA組織樣本處理方法的整理，希望對您有所幫助。組織樣本一般是制成組織勻漿，處理方法如下:1、取適量組織塊，于預冷PBS（0.02mol/L,pH7.0-7.2）中清洗去除血液，稱重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；2、可同

論述PCR反應條件的控制2022/06/28

PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。溫度與時間的設置：基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性）。PCR反應條件的控

區分三種組成物質化學成分不同細胞培養基2022/06/21

細胞培養基是人工模擬細胞在體內生長的營養環境，是提供細胞營養和促進細胞生長增殖的物質基礎。培養液或培養基的含義幾乎相同，英文都是medium。當它是粉劑時，傾向性地稱為培養基，而將粉劑配成液體后，多稱為培養液。培養液中常常補加血清、抗生素等成分。根據對培養基組成物質的化學成分是否*了解來區分，可以將培養基分為：天然培養基、合成培養基和半合成培養基。1、天然培養基天然培養基是指利用各種動、植物或微生物的原料，其成分難以確切知道。用作這種培養基的主要原料有：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩

傳代培養實驗操作步驟2022/06/14

實驗原理:傳代培養是組織培養常規保種方法之一。也是幾乎所有細胞生物學實驗的基礎。當細胞在培養瓶中長滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細胞才能繼續生長。這一過程就叫傳代。傳代培養可獲得大量細胞供實驗所需。傳代要在嚴格的無菌條件下進行，每一步都需要認真仔細的無菌操作。傳代培養實驗操作步驟:1.入無菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒雙手。2.倒置顯微鏡下觀察細胞形態，確定細胞是否需要傳代及細胞需要稀釋的倍數。將培養用液置37℃下預熱。3.超凈臺臺面應整潔，用0.1%新潔爾滅溶液擦凈。4.打開超凈臺的

解讀微生物菌種活化方式2022/06/07

菌種活化就是將保藏狀態的菌種放入適宜的培養基中培養，逐級擴大培養是為了得到純而壯的培養物，即獲得活力旺盛的、接種數量足夠的培養物。菌種發酵有一般需要2-3代的復壯過程，因為保存時的條件往往和培養時的條件不相同，所以要活化,讓菌種逐漸適應培養環境。要明白菌種活化的情況就需要了解菌種保藏的方式和方法。目前國際國內常用的菌種保存方法包括：定期移植法、液體石蠟法、沙土管法、真空冷凍干燥法、80℃冰箱凍結法、液氮超低溫凍結法。對于不同的保存方式活化的方式也不同：1、定期移植法的菌種復蘇較簡單，直接轉接即可

解決PCR產物中出現假陰性或無擴增產物2022/05/23

解決PCR產物中出現假陰性或無擴增產物（即陽性對照中有條帶，而樣品則無條帶）方法：1、條帶放置時間過久,核酸被降解，最好在48h內進行電泳檢測。2、DNA模板純度低，如含有雜蛋白質或Taq酶抑制劑，可對DNA進行再次純化或重新用優質試劑盒提取DNA;DNA濃度太低時，可以加大模板量；對具有二級結構DNA使用較好的聚合酶；提取DNA時，避免吸入酚類試劑。3、對設計不合理的引物進行重新設計合成；引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融而降解失效；檢測引物OD值并進行電泳檢測以確保兩條引物濃度一致。4、