流式抗體本身也是抗體，所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇最基本的條件：目標(biāo)蛋白特異性，反應(yīng)種屬以及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。流式抗體能夠在短時間內(nèi)檢測分析或分選大量細(xì)胞，在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)等領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛。其純度、批次穩(wěn)定性、特異性，以及流式結(jié)果的可重復(fù)性備受重視。

流式抗體熒光標(biāo)記的方式包括直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種。在流式實(shí)驗(yàn)過程中，盡量減少實(shí)驗(yàn)工序和過程，以保證實(shí)驗(yàn)的真實(shí)和準(zhǔn)確性。因此在條件允許的范圍內(nèi)，建議盡量用直接標(biāo)記的抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)而不去做間接標(biāo)記。

      隨著流式細(xì)胞術(shù)的日益發(fā)展，流式抗體及熒光標(biāo)記產(chǎn)品的種類、數(shù)量也在不斷增多，加上多色分析實(shí)驗(yàn)方案需求的增長，逐漸產(chǎn)生了抗體難選擇、熒光難搭配等問題，如何選擇合適的流式抗體，也成為了流式技術(shù)是否能成功的關(guān)鍵因素之一。下面介紹選擇流式抗體技巧：

一、滿足抗體具備的基本條件

確定所需檢測的指標(biāo)，目的細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記或胞內(nèi)標(biāo)記；

根據(jù)檢測樣本的種屬選擇抗體，流式抗體基本無法進(jìn)行種屬交叉反應(yīng)；

根據(jù)抗體的說明，明確是否可以用于流式實(shí)驗(yàn)。

二、確定所使用儀器的參數(shù)配置

激光器：不同的流式細(xì)胞儀激光器不同，常見的有405nm，488nm和635nm，需要根據(jù)具體的儀器進(jìn)行確定。

濾光片：檢測通道的多少，決定最多可以同時檢測幾個指標(biāo)。熒光素的發(fā)射波長與濾光片有關(guān)，所選擇熒光素要在儀器的可檢測范圍內(nèi)。

儀器：相同的熒光在不同的儀器上檢測通道可能不同，需要參照儀器的說明。

三、熒光的選擇

熒光有強(qiáng)弱之分，如抗原表達(dá)弱或分群不明顯的建議選擇強(qiáng)熒光，如PE、APC；反之，抗原表達(dá)強(qiáng)或分群明顯的建議選擇常用的弱熒光例如FITC即可。常用熒光強(qiáng)弱排序程度為：PE>APC>PE-cy5Cy5>PercCPp-Cycy5.5>FITC

四、多色熒光搭配

很多實(shí)驗(yàn)需要同時檢測幾個指標(biāo)，此時就需要多個熒光標(biāo)記進(jìn)行搭配。流式抗體熒光標(biāo)記搭配主要由3個因素決定的：流式細(xì)胞儀能檢測多少個通道、需要同時檢測檢測多少個指標(biāo)、的抗體有多少種熒光標(biāo)記。

能檢測多少通道是又激光決定的需要注意所使用的儀器有哪些激光。每個檢測通道只能選擇1種熒光素，各通道之間的熒光素可以隨意搭配，檢測通道不能沖突。

如果需要做多個指標(biāo)，而流式細(xì)胞儀能檢測的通道不夠，首先將指標(biāo)歸成2類，再將樣本分成2份，分別進(jìn)行檢測。

所選各種熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少，否則將會導(dǎo)致較大的補(bǔ)償。例如，PE-Ccy5與APC同時標(biāo)記，將會導(dǎo)致補(bǔ)償過度，需換成PE-Ccy5.5或PerCPcp-Ccy5.5。
五、同型對照抗體

同型對照，是用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色，類似于陰性對照，是流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)*的一項(xiàng)。

同型對照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型及亞鏈、相同熒光標(biāo)記的免疫球蛋白，也要求使用相同劑量。如一抗是抗human CD3-FITC(mouse IgG1)，同型對照則為Mouse IgG1-FITC.

如果是純化的一抗加熒光標(biāo)記的二抗，那么應(yīng)該選擇與一抗相對應(yīng)的同型對照抗體，如純化的CD3+PE標(biāo)記的二抗，則對照為純化的同型對照+ PE標(biāo)記的二抗。

有時候同型對照的表達(dá)會比抗體的表達(dá)高，首先檢查同型對照的抗體是否加錯類型、劑量等。其次，因?yàn)橛行?biāo)志在細(xì)胞的表面或者胞內(nèi)表達(dá)不高，而跟其類似的抗原非常多，那么同型對照非特異性的結(jié)合會超過抗體的特異性，所以會造成這種現(xiàn)象。這個時候推薦使用其他陰性對照，如空白對照等。