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Western Blot（WB）實驗原理和步驟

蛋白免疫印跡（Western Blot）實驗原理是什么？

術語"Blotting或印跡"指的是將凝膠中的生物樣品轉移到膜上，然后在膜表面進行檢測。蛋白免疫印跡實驗，或Western Blot（又稱為免疫印跡，因為使用了抗體來特異性檢測其抗原）于1979年由 Towbin 等人提出，現在已是常規的蛋白分析技術。抗體-抗原相互作用的特異性實現了復雜蛋白質混合物中的靶蛋白識別。通過蛋白免疫印跡實驗可獲得關于目標蛋白質的定性和半定量數據。

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本頁目錄

· Western Blot介紹

· 電泳分離蛋白質

· 將蛋白轉印到膜

· 封閉非特異性位點

· 漂洗緩沖液配方

· 一抗和二抗

· 檢測方法

一、蛋白免疫印跡（Western Blot）原理介紹

蛋白免疫印跡實驗的第一步是使用凝膠對樣品中的大分子進行電泳分離。隨后，將分離的分子轉移或轉印到另一基質上，通常是硝酸纖維素（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。接下來，封閉該膜，防止抗體與膜表面發生非特異性結合。然后通常會使用一組抗體——一種對目標蛋白質有特異性的抗體（一抗）和另一種對一抗宿主具有特異性的抗體（二抗）——對轉印的蛋白質進行檢測。

當酶標二抗與適當的底物結合后，會產生可檢測的信號。顯色底物會在膜上產生沉淀物，導致肉眼可見的比色變化。檢測方法是使用化學發光底物，產生的光信號就是該底物與酶標抗體發生反應的副產物。在膜上可以捕獲到光信號。但是，基于電荷耦合器件（CCD）鏡頭的數字成像儀器已逐漸替代暗室曝光，成為越來越普及的捕獲化學發光信號的手段。或者，也可使用熒光標記抗體，這需要使用能夠捕獲熒光信號的成像儀進行檢測。熒光印跡是一種更新的技術，且越來越受歡迎，因為這種方法可進行多重檢測（在單個印跡上檢測多種蛋白質）。無論使用什么系統，信號強度都應與膜上抗原的豐度相關。

二、蛋白免疫印跡（Western Blot）實驗檢測方法

1、蛋白免疫印跡實驗直接檢測方法

優點

· 僅需要一種抗體

· 避免了二抗交叉反應的問題

缺點

· 標記物可能干擾靶標結合

· 如果抗體對靶標的特異性較弱，可能出現高背景

· 直標一抗可能成本高昂

· 直標一抗的選擇范圍可能有限

2、蛋白免疫印跡實驗間接檢測方法

優點

· 可通過二抗進行信號放大

· 偶聯二抗選擇范圍更寬

· 一種二抗可與若干不同的一抗搭配使用

· 使用二抗不會干擾一抗與靶標結合

· 使用標記二抗有多種檢測方法的選擇

缺點

· 非特異性染色可能增加背景

· 使用間接檢測方法的步驟更多?

三、蛋白免疫印跡（Western Blot）實驗步驟

電泳分離蛋白質

凝膠電泳是使帶電分子（比如蛋白質或 DNA）在電流作用下穿過凝膠時根據其物理屬性進行分離的一種技術。蛋白質通常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進行分離，以區分混合樣品中的單一蛋白質或檢查一個樣品內的多種蛋白質。與蛋白免疫印跡結合后，PAGE 變成強大的分析工具，為我們提供關于蛋白分子量、電荷、純度或存在狀態的信息。PAGE 存在多種方法，可針對目標蛋白提供不同類型的信息。例如，非變性 PAGE（天然 PAGE）是根據質荷比來分離蛋白質。與此相反，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）是根據質量來分離蛋白質，因為與離子型 SDS 去垢劑結合的蛋白質帶負電荷。

蛋白凝膠電泳有多種緩沖系統或凝膠體系可選。當分離不同分子量的蛋白質時，每種系統都具有優勢。

在Novex Tris-甘氨酸蛋白凝膠上分離蛋白質，并用Simple Blue Safe 染料進行染色。

將蛋白質轉印到膜

電泳之后，需要將蛋白質從凝膠轉印到膜上。已經有多種方法用于該步驟，包括但不限于擴散轉印、毛細管轉印、真空印跡轉印和電轉印。常用的蛋白質轉印方法是電轉印或電洗脫，因其速度快且轉印效率高。該方法利用蛋白質的電泳遷移率將其從凝膠轉印到膜上。蛋白電轉需要將包含蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠與硝酸纖維素膜或其他合適的蛋白質結合載體直接接觸，并將其"夾在"浸入導電溶液的兩個電極之間。該過程需要使用多孔墊和濾紙來促進轉印。應用電場時，蛋白質脫離聚丙烯酰胺凝膠，移動到膜表面，并在這里緊密結合。這樣膜上就復制了原先位于聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質遷移情形。

蛋白質印跡轉印裝置。

示意圖顯示了典型蛋白質印跡裝置的組件、凝膠和膜的位置及蛋白質相對于電極位置的方向。盡管這里描述的圖像是代表性的垂直"濕式"轉印裝置，但是其方向也適用于水平放置的半干式轉印裝置。

基于蛋白質從凝膠遷移的能力，及其在一組特定條件下與膜結合的傾向，蛋白質間的轉印效率相差懸殊。轉印效率取決于多種因素，比如凝膠組分、凝膠是否與膜接觸、電極位置、轉印時間、蛋白質大小和組分、場強以及緩沖液中是否存在去垢劑和乙醇。

轉印后和進行蛋白質印跡孵育前，可用蛋白質染料評估膜上的總蛋白，以評估轉印效率。也可將凝膠染色以確認蛋白質是否已移出凝膠，但這無法確保蛋白質與膜的有效結合。因為染料可能會干擾抗體的結合和檢測，所以使用易于去除的蛋白質染料最為合適。麗春紅 S 染料是對膜上蛋白可逆染色時使用最為廣泛的試劑，但因靈敏度有限，拍照效果不佳且褪色快，導致難以成像。我們提供優質的產品，可替代該染料在硝酸纖維素膜或 PVDF 膜上進行蛋白質染色，檢測低納克水平的蛋白質，易于拍照，且在去除前不會褪色。

使用麗春紅 S 染料進行可逆蛋白質染色的比較。將預染分子量標準上樣于每塊凝膠（泳道 1），梯度稀釋未預染蛋白質分子量標準，并上樣于每塊 4-20% Tris-甘氨酸-SDS 聚丙烯酰胺凝膠（泳道 2–10）。通過電轉將蛋白質轉印到 PVDF 膜上。根據實驗方案（A 組）應用 Thermo Scientific Pierce 可逆染料染色 1 分鐘。根據實驗方案（B 組）將 0.1% 麗春紅 S 溶于 5% 乙酸，對印跡染色 5 分鐘。

電轉系統

電轉方法有多種。常用的是濕式轉印、半干式轉印和干式轉印，每種方法均需特別考慮時間、成本以及所需試劑和儀器。濕式轉印（也稱為槽式轉印）的轉印效率高，并可靈活選擇緩沖系統和方法，但費時費力。半干式轉印可靈活使用多種緩沖系統，方便省時。但是這種方法轉印大分子量（> 300 kDa）蛋白質的效率較低。干式轉印不但轉印效率高，而且快速方便，因為無需緩沖液，但可選耗材種類有限。

封閉非特異性位點

蛋白免疫印跡中使用的印跡膜對蛋白質具有高親和力。因此，從凝膠轉印蛋白質之后，請務必封閉剩余膜表面，以防在后續步驟中與檢測抗體發生非特異性結合。從牛奶或正常血清，到高度純化蛋白等的多種封閉緩沖液可用于封閉膜上的自由位點。封閉緩沖液應通過減少背景干擾并提高信噪比來提升檢測靈敏度。沒有哪一種封閉緩沖液適合每種實驗體系，因為每個抗體-抗原對都有結合特性。封閉緩沖液的實證檢測對于優化蛋白免疫印跡實驗。通常，研究人員是在實驗室配制封閉緩沖液；但商品化封閉緩沖液會更為便捷。

SuperBlock 封閉緩沖液與牛奶的比較。通過 SDS-PAGE 分離兩倍梯度稀釋的 HeLa 細胞裂解液（20、10、5、2.5、1.25、0.625 和 0.3125 µg），并將其轉印到硝酸纖維素膜（A–C 組）或 PVDF 膜（D–E 組）上。使用含 5% 脫脂牛奶和 0.05% 的 Thermo Scientific 吐溫 20 去垢劑的 Tris 緩沖鹽溶液，或者使用含 0.05% 吐溫 20 去垢劑的磷酸鹽緩沖體系的 Thermo Scientific SuperBlock 封閉緩沖液，將膜封閉 1 小時。使用 Thermo Scientific SuperSignal West Pico 化學發光底物（貨號 34580）處理印跡 5 分鐘，然后對膜曝光成像。結果表明 SuperBlock 封閉緩沖液在檢測靶蛋白方面優于牛奶。

漂洗緩沖液配方

與其他免疫檢測步驟類似，蛋白免疫印跡實驗由一系列使用不同免疫化學試劑的孵育操作和間隔的漂洗操作組成。漂洗步驟是去除未結合試劑和降低背景的必要步驟，從而可提高結果的信噪比。漂洗不充分可能導致高背景，而過度漂洗則可能會從印跡中洗脫抗體或抗原，導致檢測靈敏度降低。與蛋白免疫印跡的其他步驟相同，有多種漂洗緩沖液可供選擇。

Tris 緩沖液（TBS）和磷酸鹽緩沖液（PBS）是常用的漂洗緩沖液。大多數情況下，PBS 和 TBS 溶液可互換使用。但某些情況下，只能選擇其一。例如，在使用堿性磷酸酶（AP）標記的二抗體系中，或當使用磷酸特異性抗體檢測磷酸化蛋白質時，應使用 TBS。

漂洗緩沖液配方中有時含有去垢劑（如 0.05% 吐溫 20）以幫助去除非特異性結合物質。漂洗緩沖液中的去垢劑含量因具體檢測而異，吐溫 20等去垢劑的濃度范圍通常為 0.05% 到 0.5%。另一種常用方法是向漂洗緩沖液中添加 1:10 稀釋的封閉液。通過在去垢劑中加入封閉劑，能夠防止從膜上洗脫封閉蛋白質，或使得非特異性結合發生于溶液內的蛋白質而不是固定在膜上的蛋白質，從而將檢測中的背景直降。

請務必注意，去垢劑（比如蛋白質溶液）可能會促進微生物生長。雖然制備 NP-40、CHAPS 和 吐溫 20 等預稀釋的去垢劑儲備液很方便 ，但是在這些溶液中可能滋生真菌，從而導致高背景。此外，去垢劑可能包含大量過氧化物，使用HRP底物時會引起背景干擾。因此，請務必使用高純度去垢劑。

一抗和二抗

蛋白免疫印跡通常會使用一抗來檢測封閉過的印跡膜，這種一抗需要能夠特異性地識別一種蛋白質，或一組蛋白質上的表位（例如 SH2 域或磷酸化酪氨酸）。蛋白免疫印跡中一抗的選擇取決于要檢測的抗原以及針對該抗原可用的抗體。還請務必注意，并非所有一抗都適合蛋白免疫印跡，如有可能，應在采購新一抗之前，對其應用進行驗證。

使用 α-微管蛋白抗體進行蛋白免疫印跡。使用 Invitrogen XCell Surelock 電泳系統和 iBlot 干轉系統分析來自 8 種細胞系的裂解液。使用α-微管蛋白小鼠單克隆一抗（貨號 236-10501）和山羊抗小鼠 HRP 二抗（貨號 62-6520）檢測印跡上的 α-微管蛋白。

通常，在蛋白免疫印跡中可識別靶蛋白的一抗并不可直接檢測。因此，使用標記二抗作為最終檢測靶抗原的方式（間接檢測）。多種標記二抗可用于蛋白免疫印跡檢測。二抗的選擇取決于制備一抗的動物物種（宿主）或者一抗偶聯的標記物（例如生物素、組氨酸（His）、血凝素（HA）等）。例如，如果一抗是未標記的小鼠單克隆抗體，則二抗必須是從非小鼠宿主獲得的抗小鼠 IgG （或非 IgG）二抗。

蛋白免疫印跡抗體需要稀釋后使用，制造商通常會建議將 1 mg/mL 儲存液按照 1/100–1/500,000 的比例進行稀釋。但是，使用特定檢測系統時，指定抗體的最佳稀釋比例必須通過實驗確定。檢測系統靈敏度越高，所需抗體越少，并且可以大幅節約抗體成本，將有限的抗體應用于更多實驗中。減少抗體用量還可以降低背景，因為濃度適當的抗體對靶點具有更高的特異性和親和力。

抗體通常使用漂洗緩沖液進行稀釋。向抗體稀釋液中加入去垢劑和少量封閉劑往往有助于降低背景，從而提高信噪比。相反，向抗體稀釋溶液中添加太多封閉劑或去垢劑可能會妨礙抗體與抗原的高效結合，引起信號減弱及背景降低。

檢測方法

雖然有很多不同的標記可以與二抗或一抗偶聯，但是在蛋白質印跡檢測中選用何種標記受到檢測方法的限制。過去曾廣泛使用放射性同位素，但是它們成本高昂，有效期短，無法改善信噪比且需要特殊處理和處置。現在普遍使用酶和熒光基團作為替代標記物。

酶標記物用于蛋白免疫印跡實驗，盡管需要更多步驟。辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）（相對更少使用）是蛋白質檢測中最常見的酶標記物。一系列顯色底物、熒光底物和化學發光底物可與辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶配合使用。堿性磷酸酶與其他酶相比優勢明顯：其反應速率保持線性，僅通過延長反應時間即可提高靈敏度。然而，延長反應時間往往會引起高背景信號，導致低信噪比。辣根過氧化物酶偶聯抗體在酶和抗體的特異性活性方面均優于 AP 標記抗體，因HRP酶的尺寸更小且與偶聯反應的兼容性好。另外，底物的高活性率、良好的穩定性、低成本和普及性使得 HRP 成為大多數應用的酶。

因為有多種底物可選，酶標抗體為蛋白免疫印跡提供了極大的檢測和成像靈活性。檢測/成像系統是使用顯色底物。雖然不像其他底物那么靈敏，但是顯色底物可實現信號顯影的直接可視化。然而，隨著印跡干燥或者在儲存過程中，顯色底物容易褪色，使得保存印跡膜成為不可靠的記錄方式。然而，要復制或直接掃描印跡以記錄顯色蛋白質印跡結果，操作相當簡單。

化學發光印跡底物與其他底物的不同之處在于，酶與底物發生反應時產生瞬時信號，該信號僅在反應進行時才會持續。如果底物被耗盡或酶喪失活性，則反應將停止，且信號將會丟失。然而，在抗體濃度適當和底物重組的優化檢測體系中，反應產生的穩定光輸出可持續 1 到 24 小時（具體視底物而定），從而可用 X 光膠片或數字成像系統進行成像，實現一致性好、靈敏度高的檢測。雖然 X 光膠片可用于獲得半定量數據，但是數字成像系統更為靈敏，線性動態檢測范圍更寬，并且研究人員可從蛋白印跡中獲得定量數據。

使用熒光標記抗體所需步驟更少，因為檢測中無需底物顯影。雖然實驗操作更少，但是由于需要激發光源，該方法需要特殊設備才能檢測熒光信號并成像。隨著數字成像系統的最新進展，以及紅外、近紅外和量子點等新一代熒光基團的研發，提高了使用熒光探針進行蛋白免疫印跡和其他免疫檢測的靈敏度和普及程度。盡管設備和熒光標記抗體可能非常昂貴，但是本方法具有多通路兼容的額外優勢（在統一實驗中使用多個熒光基團）。另外，與其他印跡技術相比，這種方法產生的化學廢物更少。

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