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SDS-PAGE蛋白凝膠電泳原理和實驗步驟

蛋白凝膠電泳（SDS-PAGE）是一種在進行下游檢測或分析前分離蛋白混合物的簡單方法。我們提供高效的蛋白凝膠電泳方案，涵蓋蛋白分析實驗所需的蛋白預制膠、電泳槽、手灌膠系統、染料、蛋白Marker、電泳緩沖液、電泳儀電源和轉印系統等產品。

賽默飛提供多種SDS-PAGE蛋白凝膠電泳產品，請訪問獲取產品最新信息。

什么是SDS-PAGE蛋白凝膠電泳？

蛋白凝膠電泳是一種在進行下游檢測或分析前分離蛋白混合物的常規方法，在提取、鑒定和表征蛋白的眾多工作流程中，蛋白凝膠電泳是非常關鍵的一個步驟。

電泳是指溶液中的帶電顆粒在電場作用下發生移動的現象。電泳是一種可對蛋白和核酸進行簡單、快速、靈敏的分離與分析的手段。任何帶電離子或顆粒在電場作用下都會發生移動。多數生物分子在等電點以外的任何 pH 值下都帶有凈電荷，并且移動速度與電荷密度成正比。

賽默飛蛋白預制膠套裝

凝膠基質

常用于電泳的基質有兩種：聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠。這兩種基質屬于多孔介質，作用類似于分子篩。分子的分離度取決于基質的凝膠孔徑大小。瓊脂糖具有大孔徑，是分離核酸和蛋白復合物等大分子的理想基質。聚丙烯酰胺的孔徑較小，更適合分離大多數蛋白、肽段和較小的核酸。

聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)

聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺單體聚合而成。這些單體在添加了能與鏈末端的自由官能團發生反應的雙官能團化合物（如N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺，bis）后，可交聯成長鏈。凝膠的孔徑大小取決于丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的濃度。丙烯酰胺的濃度越高，凝膠孔徑越小，這有助于提高低分子量分子的分辨率，反之亦然。

聚丙烯酰胺凝膠電泳可通過調整如下條件，根據不同應用需求來分離蛋白：

• 丙烯酰胺基質

• 緩沖液系統

• 電泳條件

丙烯酰胺基質

線性凝膠與梯度凝膠

具有單一丙烯酰胺百分比濃度的凝膠稱為線性凝膠，丙烯酰胺濃度是某一范圍的凝膠稱為梯度凝膠。梯度凝膠相較于線性凝膠的優勢為可在更寬的分子量范圍內均勻地分離蛋白。

連續凝膠與非連續凝膠

研究人員有時會將凝膠分為連續凝膠和非連續凝膠。連續凝膠是在整個凝膠盒中采用單一丙烯酰胺溶液制作而成的凝膠。非連續凝膠則采用兩種丙烯酰胺溶液制備：少量的低百分比濃縮膠（其中預留蛋白上樣孔），以及大量的用于分離蛋白的分離膠。在傳統的 Tris-甘氨酸蛋白凝膠系統中，濃縮膠位于高電泳遷移率的前導氯離子（存在于凝膠緩沖液中）與低電泳遷移率的甘氨酸尾隨離子（存在于電泳緩沖液中）之間，蛋白在該濃縮膠中進行堆積。使用濃縮膠主要是為了提高凝膠中蛋白條帶的分辨率。這些堆積的蛋白條帶在進入分離膠后開始進行篩分。

小型蛋白凝膠與中型蛋白凝膠

我們提供兩種規格的即用型預制膠：小型膠和中型膠。兩種凝膠的電泳距離相同，但中型膠的尺寸更寬，因此上樣孔數量更多或上樣孔容量更大。中型膠中額外增加的上樣孔數量或孔徑，可以容納更多樣本數量或更高的樣品體積。

緩沖液系統

電泳需要在連續或不連續的緩沖液系統中進行。連續緩沖系統使用同一種凝膠緩沖液和電泳緩沖液。不連續緩沖液系統使用不同的凝膠緩沖液和電泳緩沖液[1]。不連續緩沖液系統還可以使用兩層孔徑不同、緩沖液組分不同的凝膠層（濃縮膠和分離膠）。使用不連續緩沖液系統進行電泳可使樣品在濃縮膠中堆積，從而獲得更高的分辨率。

電泳條件

蛋白的分離方式取決于使用的電泳條件，下面介紹一些常見條件。

變性條件 (SDS-PAGE)

變性電泳是在使用陰離子去垢劑如十二烷基硫酸鈉 (SDS)進行變性的條件下進行的電泳。SDS 通過包裹疏水部分使蛋白變性并展開。SDS 以 1 g 蛋白對應 1.4 g SDS 的比率結合。得到的 SDS-蛋白復合物帶負電，按照分子大小在凝膠中分離。

非變性條件（天然 PAGE）

電泳是在非變性（天然）條件下，使用可以維持天然蛋白構象、亞基相互作用和生物學活性的緩沖液系統進行的電泳。在天然電泳過程中，蛋白的分離基于荷質比。

還原條件

使用還原劑，例如二硫蘇糖醇 (DTT)、β-巰基乙醇 (β-ME)或鹽酸三-(2-羧乙基)膦 (TCEP) 在還原條件下進行電泳。還原劑切割半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，將變性的蛋白展開，分解成亞基。

1D 和 2D PAGE 對比

蛋白凝膠電泳最常見的形式是采用一維 (1D) 電泳對多個樣品進行比較分析。具體流程為：將樣品加入上樣孔中，施加電流分離蛋白，然后通過染色或免疫印跡將蛋白條帶的遷移

情況可視化。

使用二維電泳 (2D-PAGE) 可以對單個樣品的多個成分進行解析。第一向等電聚焦 (IEF) 電泳根據蛋白的天然等電點 (pI) 分離蛋白。第二向電泳采用常規的 SDS-PAGE 根據分子量分離蛋白。2D-PAGE 可以為蛋白分析提供最高的分辨率，是蛋白組學研究中的一項重要技術。在這類研究中，有時需要在單塊凝膠上解析成千上萬種蛋白。

蛋白凝膠系統介紹

PAGE 利用不連續的緩沖液系統，在開始電泳時將樣品濃縮或“堆積"到濃縮膠中非常窄的區域內。在不連續緩沖液系統中，凝膠中的主要陰離子與電泳緩沖液中的主要陰離子不同（或不連續）。Invitrogen™ Bolt™ Bis-Tris Plus 預制膠，Invitrogen™ NuPAGE™ Bis-Tris 和 Tris-乙酸預制膠，以及基于 Laemmli 系統的 Invitrogen™ Novex™ Tris-甘氨酸預制膠都是不連續緩沖液系統，具有類似的工作方式。但是，由于不同系統中的離子組成，Bis-Tris 和 Tris-乙酸系統需要在較低的 pH 值下工作。

Tris-甘氨酸系統

Tris-甘氨酸系統（圖 1）主要包含如下三種離子：

圖 1.Tris-甘氨酸預制膠系統。凝膠緩沖液中的離子為 Tris 和氯離子 (pH 8.7)；電泳緩沖液中的離子為 Tris、甘氨酸和 SDS (pH 8.3) ；凝膠的工作 pH 值為 9.5。

· 凝膠緩沖液提供的氯化物 (–) 離子，作為前導離子(快離子)，因為相對于系統中的其它陰離子，它對陽極的吸引力最高。

· 電泳緩沖液提供的甘氨酸 (–) 離子，是系統中的主要陰離因為這些離子僅部分帶負電，并且在帶電環境中始終跟隨帶電量更高的氯離子，因此作為尾隨離子（慢離子）。

· Tris 堿 (+) 離子是一種在凝膠和電泳緩沖液中均存在的緩沖配對離子。電泳期間，Tris-甘氨酸系統中的凝膠和緩沖離子在凝膠的分離區域形成 pH 9.5 的工作環境。

Bis-Tris 系統

Bis-Tris 系統（圖 2）主要包含如下三種離子：

• 由凝膠緩沖液提供的氯離子 (–)，作為快速移動的前導離子。

• MES 或 MOPS (–) 離子（取決于電泳緩沖液的選擇），作為尾隨離子。

– MES：2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸

– MOPS：3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸

• 電泳緩沖液中提供Tris (+) 離子，凝膠中存在的 Bis-Tris (+)離子則為緩沖配對離子。

組合使用 pH 值較低的凝膠緩沖液 (pH 6.4) 和電泳緩沖液(pH 7.3–7.7)，可在電泳過程中顯著降低工作 pH (pH 7.0)，從而實現更好的樣品完整性和凝膠穩定性。

Tris-乙酸系統

Tris-乙酸系統（圖 3）主要包含如下三種離子：

• 乙酸根 (–) 離子，來自凝膠緩沖液的前導離子

• Tricine (–) 離子，來自電泳緩沖液的尾隨離子

• Tris (+) 離子，作為緩沖配對離子（凝膠和緩沖液中均存在）

該系統的工作 pH 值也比 Tris-甘氨酸系統低得多，從而減少了凝膠引發的蛋白修飾。

Tricine 系統

Tricine 系統是傳統 Tris-甘氨酸凝膠系統的改進版本，使用了不連續緩沖液系統，專用于解析 2-20 kDa 范圍的低分子量蛋白。通過重新配制 Laemmli 電泳緩沖液，并使用Tricine 代替甘氨酸，使 SDS -多肽在緊隨前導離子前沿的位置形成，而不是與 SDS 前沿共同電泳，因此可以將它們分離為離散的條帶。

實現理想蛋白分離的產品

蛋白預制膠

優化的蛋白凝膠體系，適用于寬范圍的蛋白靶點分析。每種體系均有齊全的濃度和孔數選擇，您也可選擇手灌膠系統來手工制備蛋白凝膠。

電泳緩沖液

SDS-PAGE蛋白凝膠電泳緩沖液、非變性電泳緩沖液，以及用于制備手灌膠、凝膠上樣、凝膠電泳和轉印的試劑。

蛋白Marker

預染、非預染和 western blot 顯影蛋白分子量標準。適用于SDS-PAGE、蛋白免疫印跡（western blot）和等電聚焦電泳（IEF）等。

蛋白凝膠染料

蛋白染料種類齊全，滿足從快速染色到高靈敏度染色等應用所需。

賽默飛高品質蛋白電泳產品方案涵蓋蛋白凝膠、蛋白染料、蛋白分子量標準、電泳緩沖液和轉印設備等，可為您的不同實驗需求提供針對性方案。

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