BCA法測蛋白濃度是通過比色檢測進行總蛋白質定量的常用方法。相比基于考馬斯染料的定量方法（Bradford 法定量）,Pierce BCA 蛋白定量試劑具有優勢，因為它們可以兼容含有多達 5％ 表面活性劑（去垢劑）的蛋白樣品，并且受蛋白組成差異的影響小得多，從而具有更高的蛋白間均一性。
賽默飛最新推出的內含免稀釋蛋白標準品的 BCA 蛋白定量試劑盒最多可將實驗時間縮短80%。免稀釋蛋白標準品是一組與排槍兼容的預稀釋標準品，使您可以輕松地將稀釋好的標準品一步轉移到微孔板中。
賽默飛提供BCA蛋白定量和Lowry蛋白定量產品，請訪問獲取產品最新信息。根據您的蛋白樣品選擇合適的BCA蛋白定量試劑盒。
BCA 蛋白定量試劑盒概述
· 免稀釋Rapid Gold BCA 快速蛋白定量試劑盒——綠色至黃色（A480 nm），雙組分的精確定量試劑，兼容去垢劑，僅需室溫下孵育5分鐘，即可測定總蛋白與蛋白質標準品的濃度。
· BCA 蛋白定量試劑盒（內含免稀釋標準品）——綠色至紫色（A562 nm），雙組分的精確定量試劑，兼容去垢劑，37°C下孵育30分鐘以檢測總蛋白質濃度與蛋白質標準品。
· 還原劑兼容型 BCA 蛋白定量試劑——經典 BCA 試劑盒的還原劑兼容型版本 ，用于測量含有 DTT 或 BME 硫醇還原劑的樣品的蛋白濃度。
· 微量 BCA 蛋白定量試劑——三組分 BCA 試劑盒，專門用于測量稀釋蛋白溶液（0.5 至 20 μg/mL）中的總蛋白濃度。
輕松、快速、準確
熱門BCA 蛋白定量試劑盒現自帶免稀釋 BSA 蛋白標準品——7個濃度的預稀釋BSA標準品，專為排槍設計。
Pierce 免稀釋蛋白定量產品可大幅減少傳統定量實驗中繁瑣的稀釋操作，并使用來自美國國家標準與技術研究院 (NIST) 的純化 BSA進行校準，以確保標準曲線的準確性。
BCA法測蛋白濃度法原理
BCA 蛋白定量的化學反應
Pierce BCA 蛋白定量試劑通過在堿性環境中用蛋白質將 Cu2+ 還原為 Cu+（廣為人知的雙縮脲反應），然后通過二辛可寧酸（BCA）對亞銅陽離子（Cu+）進行高靈敏度和高選擇性的比色檢測。
圖 1.第一步：將銅與堿性環境中的蛋白質螯合，形成藍色復合物。在此反應中，含有三個或三個以上氨基酸殘基的肽與含酒石酸鈉鉀的堿性環境中的二價銅離子形成有色螯合物。
單個氨基酸和二肽在雙縮脲反應中不受影響，但三肽以及更大的多肽或蛋白質會發生反應，產生吸收峰位于 540 nm 的淡藍色至籃紫色復合物。一個二價銅離子與附近四到六個多肽結合形成有色螯合物。產生的顏色強度與參與反應的肽鍵數目成正比。
圖 2.第二步：BCA 試劑是一種高靈敏度、高選擇性的比色檢測試劑，與第一步形成的亞銅陽離子（Cu+）反應，產生紫色。
BCA– 銅復合物是水溶性的，在 562 nm 處具有強線性吸收，吸收度隨蛋白濃度增加而升高。在 550 至 570 nm 波長范圍內，可對紫色進行測量，此范圍內信號丟失最小（少于10 %）。BCA 試劑產生的信號約比使用雙縮脲試劑產生的信號靈敏100 倍（檢測下限更低）。
Pierce 免稀釋Rapid Gold BCA 蛋白定量試劑采用與經典 BCA 定量試劑相同的銅離子還原法，并含有銅螯合劑。在顯色反應的第二步中，Pierce 免稀釋Rapid Gold BCA 螯合劑與第一步還原產生的亞銅陽離子（Cu+）反應，產生一種深金色反應產物。此銅復合物隨著蛋白濃度的增加，在 480 nm 波長處表現出強烈的線性吸光度。
免稀釋 BCA 蛋白定量
免稀釋 BSA 蛋白標準品可單獨購買，部分熱門BCA蛋白定量試劑盒里面已內含免稀釋標準品。與 Bradford法或 Pierce BCA Protein Assay 試劑盒相比，免稀釋Rapid Gold BCA 蛋白定量試劑盒無需稀釋樣品和標準品，從而可將實驗時間減少高達 80%。 此外，它只需要 5 分鐘的室溫孵育。 經典BCA試劑盒也有內含免稀釋 BSA 蛋白標準品的版本—— Pierce 免稀釋BCA Protein Assay 試劑盒。
圖 3. 與其他蛋白質檢測相比，Pierce 免稀釋Rapid Gold BCA蛋白定量試劑盒最高可將實驗時間縮短 80%。 按照說明書中的方案在微孔板中進行實驗。 樣品共10個：5個細胞裂解物樣品、5個純化蛋白樣品。BCA 和 Bradford 法的標準曲線是通過連續稀釋 2 mg/mL 牛血清白蛋白 (BSA) 標準品生成的。Pierce 免稀釋Rapid Gold BCA 蛋白定量試劑盒的標準曲線是使用內含的兼容排槍的Pierce 免稀釋 BSA 蛋白標準品生成的。十個樣品中的四個預計起始濃度 > 2 mg/mL，因此BCA 和 Bradford 法需要進行樣品稀釋，但免稀釋Rapid Gold BCA 試劑盒不需要稀釋樣品。然后將樣品與各個試劑盒的工作試劑混合并按照說明書進行孵育。
BCA法測蛋白濃度的優點
BCA法蛋白定量
BCA 法定量的主要優點之一是它可產生一條線性響應曲線。此響應曲線有助于準確測定未知蛋白的濃度，并具有比其他常規定量方法更寬的動態范圍。
圖 4. Pierce 免稀釋Rapid Gold BCA 蛋白定量試劑盒可在寬動態范圍 (0–10 mg/mL) 內生成線性標準曲線。 使用溶于0.9% 生理鹽水中的純化 BSA (0–10 mg/mL) 為 Pierce 免稀釋Rapid Gold BCA 蛋白定量試劑盒和Quick Start Bradford 蛋白定量試劑盒 (Bio-Rad) 制作標準曲線。 兩種方法均按照說明書中的方案在微孔板中進行實驗。 使用 Thermo Scientific Varioskan LUX 多功能酶標儀讀取吸光度數據。
BCA法測蛋白濃度的準確度
BCA 法蛋白定量的另一個主要優點是蛋白間差異較低。蛋白的組成和結構具有高多樣性，在一些檢測中，蛋白在氨基酸序列、等電點（ pI ）、二級結構和側鏈或輔基上的差異會導致比色響應的差異。由于蛋白間差異較低，BCA 蛋白定量方法能夠更準確地測定未知樣品的蛋白濃度。
圖 5. Pierce 免稀釋Rapid Gold BCA 蛋白定量試劑盒和Quick Start Bradford 蛋白定量試劑盒的實驗結果與樣品的已知濃度對比。兩種方法均按照說明書中的方案在微孔板中進行實驗。對于 Bradford 法，將 5 μL 樣品添加到 250 μL Bradford 工作試劑中，并在室溫下孵育 5 分鐘。 對于免稀釋Rapid Gold BCA 法，將10 μL 樣品添加到200 μL 免稀釋Rapid Gold BCA 工作試劑中，并在室溫下孵育5 分鐘。 蛋白樣品的已知濃度信息來自廠家，并通過 280 nm 處的吸光度進行確認。
BCA 蛋白定量實驗方案
使用免稀釋 BSA 蛋白標準品進行 BCA 蛋白定量
Pierce BCA 蛋白定量試劑產生線性響應曲線（R2 > 0.95），可根據檢測未知樣品蛋白濃度所需的動態范圍，選用兩種不同的方案進行檢測。標準 Pierce BCA 蛋白定量試劑使用雙組分系統檢測 20 至 2000 μg/mL 的蛋白質濃度：試劑 A 是含有 BCA 試劑的碳酸鹽緩沖液，試劑 B 是一種硫酸銅溶液，兩者結合制成一種蘋果綠色的工作溶液，在蛋白存在的情況下，30 分鐘后在 37℃ 下變成紫色。由于顏色反應不是真正的終點反應，Pierce BCA 蛋白定量具有相當大的實驗方案靈活性。可以通過增加孵育溫度提高檢測的靈敏度。使用增強型試管方案（即在 60°C 下孵育 30 分鐘）時，檢測工作范圍變化為 5–250 μg/mL，可實現稀釋蛋白樣品的準確定量。
圖 6. BCA 蛋白定量試劑盒（內含免稀釋標準品）搭配排槍進行蛋白定量實驗。
Rapid Gold BCA 蛋白定量試劑盒的實驗方案
該比色測定法延續了 BCA 定量的高靈敏度和線性度，極大縮短孵育時間，可以更快地進行標準 BCA 定量操作。該方法可在室溫下于 5 分鐘內完成孵育，無需長時間等待或者將樣品置于高溫下。
圖 7. 免稀釋 Rapid Gold BCA 蛋白定量試劑盒實驗方案。
BCA法測蛋白濃度常見問題：
Q. 哪些物質會干擾BCA定量分析的結果？
A. 部分干擾 BCA 定量分析的物質包括還原性物質、螯合劑以及強酸或強堿，即使濃度很低也可能會影響定量的結果。
另外。一些物質對 BCA 定量分析方法的干擾程度較低，當其在原始樣本中含量低于某特定濃度時，僅對結果造成微小影響（可耐受）。此外，多種干擾物質可能產生加和作用，例如當樣本緩沖液中含有多種干擾物質時，即使其中單一干擾物質的濃度低于可兼容濃度，總體仍有可能對蛋白質的定量分析產生干擾。
Q. BCA法與Bradford法應如何選擇？
A. 主要由樣本中的干擾物質決定。如果你的蛋白抽提試劑中含有大量去垢劑且不含有螯合劑、還原劑時，可使用BCA法；如果你的蛋白里含有EDTA等金屬螯合劑或者含有還原型物質，且不含有去垢劑時，可使用Bradford法。
Q. 蛋白抽提完是否可以直接蛋白定量？
A. 依據測試過的數據，Thermo Scientific M-PER， RIPA總蛋白抽提試劑，Mem-PER Plus膜蛋白抽提試劑，NE-PER核蛋白抽提試劑，亞細胞組分分離試劑盒等均可直接使用BCA進行蛋白定量，T-PER抽提后 的蛋白經過稀釋可使用BCA進行定量。
Q. BCA法能檢測多肽濃度嗎？
A. 不能，檢測多肽濃度需要用專門的多肽濃度檢測試劑盒，如Pierce™ Quantitative Fluorometric Peptide Assay（貨號23290），或Pierce™ Quantitative Colorimetric Peptide Assay（貨號23275）。
Q. BCA法需要孵育至少30分鐘，有沒有更快的方法？
A. 全新Pierce 快速Gold BCA試劑盒（貨號A53225， A53226），只需孵育5分鐘，室溫下即可進行。此外，Gold BCA試劑盒保留了經典BCA法的高線性、高去垢劑兼容性和低蛋白差異性，使用更加快捷、簡便。
賽默飛提供BCA蛋白定量和Lowry蛋白定量產品，如需了解完整的實驗方案，請查閱BCA法測蛋白濃度試劑盒說明書或登錄賽默飛下載電子版說明書。
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