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盤點RACE技術的幾種類型及特點2021/09/16

在分子生物學中，未知基因全長序列的獲取是研究新基因的重要步驟。當我們不清楚目的基因的完整序列時，獲得未知序列的方法有反向PCR、mRNA差異顯示技術、基因組減法技術以及cDNA文庫篩選技術等等......背景介紹今天我們來一起了解一種可從低豐度轉錄本中獲得cDNA末端序列的方法—RACE技術。當我們不清楚目的基因的完整序列，只知道其中的一段序列時，就可以通過RACE技術獲得mRNA兩端序列，再與已知序列拼接，從而得到完整mRNA序列。相比其他獲得mRNA全長的技術，RACE具有簡單、快速、廉價的

搞定內參，駕馭 Western blot 已成功一半2021/09/15

westernblot對絕大多數實驗新人而言，絕對是心中痛，一碰就要抓狂。沒辦法,誰讓導師發話了，WB做不好，延畢就是分分鐘的事兒。這還真是讓小伙伴們感嘆道，WB想說愛你不容易。那么為了*馴服WB，獲得漂亮且理想的實驗結果，一個良好的參照體系就絕對是*的存在。一般而言，良好的參照體系包括：*體重計（分子量marker）：可確定蛋白條帶對應的分子量大小*光桿司令（空白對照）：不加一抗和二抗，用于檢測膜的性質的封閉效果*好榜樣（陽性對照）：已知量標準產物的正對照，可檢測抗體的工作效率*打醬油的（陰性

用磷酸化抗體做Western Blot時，要注意哪些？2021/09/15

今天給大家分享一下在用磷酸化抗體做WesternBlot時，應該注意些什么。1.警惕內部敵人一定要在lysisbuffer中加入蛋白酶抑制劑，還要加入一定量的磷酸酶抑制劑，因為組織或細胞裂解時會釋放出大量磷酸化蛋白的死對頭——內源性蛋白磷酸酶，催化磷酸化蛋白(R-p)的去磷酸化，導致不同于正常生理狀態的差異。因此，外源性加入蛋白磷酸酶抑制劑，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，維護蛋白質的磷酸化狀態，否則即使band壓出來也會很淺，結果也不可信。2.低溫能讓他們緊緊地擁抱對方加一抗后最好4度過夜，低溫能讓

Western blot實驗結果分析2021/09/15

Westernblot實驗結果分析①微笑條帶解析：由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現于較厚的凝膠處理辦法：配膠時一定要充分混勻，待其充分凝固后再做后續試驗②帶出現紋理現象解析：樣品不溶性顆粒處理辦法：加樣前最好是離心一下樣品③電泳條帶粗（這是個內參β-actin）解析：蛋白樣品沒有濃縮，量太大④條帶出現好多洞洞解析：轉膜的時候沒有把三明治里的氣泡干掉WesternBlot是生物學上一種非常常用的實驗方法，與之相似的還有SouthernBlot和NorthernBlot。但WB失敗的情況也很

WB的免疫印跡操作分享2021/09/14

①膜處理（甲醇1min，風干（放濾紙上），甲醇1min，水1min）②封閉（用TBST配5%牛奶）1h配搖床③加一抗，牛奶稀釋,所需濃度參考抗體說明書，看膜的大小配多少一抗，4°過夜。④室溫孵育20min⑤0.1%TBST洗10minx3次配搖床（0.1%TBST：tris12.1g，NaCl87.66g，HCl至PH7.6后定容至1L后，加入1ml的TWEEN20）⑥加二抗，牛奶稀釋，一般1:10000，1h配搖床⑦0.1%TBST洗10minx3次配搖床⑧發光（A液B液等體積混合，孵膜1mi

WB過程中最重要的環節——轉膜2021/09/14

①跑到溴酚藍距離最下緣25px時配電轉液（tris3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇100ml，定容至1L）②在電轉液中剝膠，裁膠，剪膜，膜活化（甲醇1min，去離子水1min，電解液15min）③“三明治”黑板~海綿~三層濾紙~膠~膜（正面朝下，分清左右，與膠對應）~3層濾紙~海綿~白板，夾緊后放入電轉槽中。（海綿，濾紙，膜需浸潤透，過程中不能干，趕趕氣泡）④連接電源，一定要注意紅對紅，黑對黑，定電流和時間（150mA，1h，若分子量大于90，再加200mA，2h）具體情況具體分析經驗總結：溴

WB電泳技巧分享2021/09/14

①清洗玻璃板，去離子水沖，風干或烤干（一定要以處女座的精神去嚴格要求自己把板子洗干凈，相當重要）②按說明書配膠。先配下膠（分離膠），一般兩塊板配10ml的10%的膠（20~80kDa通用）膠的濃度根據你所需要跑的蛋白的分子量大小決定,混勻后灌膠，立即用正丁醇或無水乙醇封，待凝固后倒出正丁醇，用去離子水沖洗，濾紙吸干；③配上膠（積層膠），參考說明書，一般兩塊板配4ml的5%的膠，混勻后灌膠，插板,待凝固。（可4°過夜）④配電泳液（tris3.03g，甘氨酸14.4g，SDS1g，定容至1L）⑤將玻

蛋白樣品的制備與定量2021/09/14

（1）提細胞蛋白①消化或刮下細胞至1.5的EP管中，標記，10000r離心2min，PBS洗3遍②吸去EP管中PBS，最好用濾紙吸干里面的水分，加適量RIPA裂解液（RIPA裂解液：蛋白酶抑制劑=250:1），如果你想做信號通路指標還得再加上磷酸酶抑制劑（磷酸酶抑制劑：RIPA裂解液=1:1000）③冰上裂解30min~1h，開4°離心機④4°離心11000r，20min⑤測蛋白濃度，取上清，加蛋白上清的四分之一體積5x上樣loadingbuffer，煮沸，分裝（蛋白質變性）（2）提組織蛋白①研

三天征服Chip的經驗分享2021/09/13

在科研界，CHIP無疑是高冷的女神，在追逐的過程總是分分鐘虐得體無完膚，糟心的實驗結果更是分分鐘想去“狗帶”。征服CHIP的路上，有多虐心就有多少要注意的地方。慶幸的是，曾得到女神青睞的前輩們積累了不少經驗。好的經驗要分享，特地總結了各位高手們做CHIP的經驗，在此奉上，希望能助大家一臂之力。染色質免疫共沉淀（chromatinimmunoprecipitation，CHIP）是目前研究體內DNA與蛋白質相互作用的*方法，能夠比較真實的反應細胞內轉錄因子TF與啟動子Promoter的結合情況。其

CO-IP沒有條帶的常見原因和解決的辦法2021/09/13

CO-IP并不容易做，尤其是兩個蛋白豐度低，相互作用力較弱的時候。做CO-IP經常會遇到沒有條帶的問題。這里談談CO-IP沒有條帶的常見原因和解決的辦法，更有獨門配方獻上。蛋白濃度過稀絕大多數情況下，CO-IP沒有條帶是由于蛋白濃度過稀。裂解產物的蛋白濃度越高越好。但是，有些實驗室喜歡稀釋裂解樣品的蛋白濃度再做CO-IP。其實，在大多數情況下要盡可能避免稀釋你的細胞裂解液。盡量使細胞裂解產物的蛋白濃度可達7-8mg/ml左右。這才會避免發生沒有條帶的情況。沒有裂解開很多時候，由于裂解液不夠強烈，

染色質免疫共沉淀值得注意的15個細節2021/09/13

染色質免疫共沉淀，又叫Chip（ChromatinImmunoprecipitation）。Chip又正好是英語里面薯片的意思。為了有趣，就叫薯片實驗吧。做薯片做了幾個月，時間不長，但深刻體會到了魔鬼都在細節中和細節決定成敗。現在把值得注意的15個細節總結如下：1、cellcounting：盡量做到準確準確再準確，否則會影響input結果。2、crosslink：甲醛的終濃度是1%，這個基本所有的protocol上都會強調。3、resuspendcellswithSDS:一定要選用小的tip頭，

分享染色質免疫共沉淀的方法2021/09/13

目前，不斷發展的DNA和蛋白質相互作用的方法和技術已經成為研究DNA復制、重組、修復和轉錄的核心。今天跟大家分享的是花樣百出、拽酷炫的染色質免疫共沉淀的方法！染色質免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,CHIP)原理值得注意的是，它是目前*個研究體內DNA與蛋白質相互作用的方法。在生理狀態下，把細胞內的DNA與蛋白質交聯在一起，通過超聲或酶處理將染色質切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來，以富集存在組蛋白修飾或者轉錄調

ELISA實驗操作中值得關注的細節大盤點2021/09/10

酶聯免疫吸附測定（ELISA）因其具有敏感性高、特異性強等優點，被廣泛應用于臨床檢測中的各種抗原和抗體的測定。盡管ELISA操作簡單，但是小實驗里也蘊含著大文章，ELISA操作各個環節對實驗的檢測效果影響較大，稍不注意就會產生假陽性或假陰性的結果。現在就跟大家818應用ELISA應該了解的一些常識。ELISA分類及具體過程一般，ELISA可分為以下四大類：直接ELISA、間接ELISA、夾心ELISA、競爭抑制ELISA。其他的ELISA都隸屬于這四類ELISA或由這四類ELISA組合衍生。下面

ELISA實驗中常遇到的問題、產生的原因與解決辦法2021/09/10

酶聯免疫吸附實驗，簡稱為ELISA。ELISA實驗是一種非常經典的免疫學實驗。雖然歷史非常悠久了，但是還是不斷地在臨床和基礎研究中得到應用。其主要用于：免疫酶染色各種細胞內成份的定位；研究抗酶抗體的合成；顯現微量的免疫沉淀反應；定量檢測體液中抗原或者抗體成份。小編總結了一些經驗教訓。遇到的問題，可能的原因，解決方法。供大家參考。問題1：陽性與陰性不能達到2.1的比值，陰性顏色太深。可能的原因：陰性對照（也就是陽性對照的除目標抗原外的其它成分）中有某種成分與一抗作用。解決的方法：純化抗原除去干擾成

一句話知曉實驗方法怎么選？2021/09/08

在分子生物學實驗室里的玩法，無非就是用某種特定的刺激物（如細胞活素）去刺激一些細胞或組織，讓它們high起來，然后分析細胞對這些外源刺激物的反應，檢測細胞內哪條信號通路被激活或失活，或者什么蛋白被分泌出來。這里面就有很多種方法，哪種最合適，關鍵看你要檢測這個反應的哪個方面的特性。WB建立蛋白質的個人檔案一個典型的免疫印跡實驗（WesternBlot，WB）可檢測信號通路中某種蛋白質的特性、表達和分布，分析容量大、敏感度高、特異性強。但至于蛋白-蛋白相互作用則要用另一種更復雜的方法，即免疫共沉淀法

免疫組化（IHC）的10大實戰經驗（附臨床上常用免疫組化指標）2021/09/08

1.把要做的切片先分好，做幾個抗體可分幾盒，不正常組織與正常組織要分開。其余做預實驗用。2.選擇實驗要做的抗體時，要結合他們的正常組織和癌組織的分別表達率。3.試劑盒的選擇可結合生物素強弱的情況。如：肝組織生物素含量高，S-P試劑盒生物素含量也高，故不能配合使用。4.每次開始做時，都必須先清點實驗的必需品是否齊全。想好可能發生的意外，并先想好補救措施。當抗體不夠用的情況下，原先買的抗體最好不要用完，留做可能需要的驗證試驗。新的抗體要盡量同公司，同批號。5.烤片（單一或綜合）程度要適情況而定，可中

免疫組化之8大疑難解答2021/09/08

IHC常見的8大疑問Q1：冰凍切片和石蠟切片如何取材？Answer:冰凍切片取材可分為兩種情況：1）動物灌流固定：如小鼠心臟灌流，首先采用預冷的1×PBS灌流沖洗直至血液全部放出，隨后灌注4%PFA直至小鼠僵直，而后解剖獲取組織，于4℃、4%PFA中固定1h左右，1×PBS洗5次（30min/次），25%蔗糖溶液脫水12h左右包埋即可。2）直接取材：直接選擇新鮮組織進行冰凍切片，此時不需要進行抗原修復。缺點：切出的片子含水量會比較多，形成冰晶影響結果，而且后期的丙酮固定也會改變細胞的形態。石蠟切

免疫組化結果分析應該注意的一些事項和技巧2021/09/08

很多時候，我們千辛萬苦地染出了一張張漂亮的免疫組化片子。但是卻不知道如何正確地分析，得出理想的結果。這實在是一件憾事。其實，免疫組化結果分析的protocol教科書和實驗手冊上面都有。今天主要談談應該注意的一些事項和技巧，并且有獨門絕招獻上，都是干貨喲。對照染色和做實驗的時候必須設立對照組一樣，免疫組化也必須設立對照染色。沒有對照染色的免疫組化結果是不可信的。對照一般有陽性組織對照，陰性組織對照，陰性試劑對照，自身對照。一般來說，有一個陽性組織對照和一個陰性組織對照就足夠了。定位抗原表達必須在特

如何避免掉進做免疫組化時導致非特異性染色的八大坑？2021/09/08

全國江山一片紅，這可不是閱兵日的朋友圈，而是在做免疫組化啊！好好的一張片子染得臟臟的。一下子整個人都不好了。這里，總結出了導致非特異性染色的八個大坑，以及避免掉坑里的一些做法。皆是獨門絕技，不要眨眼咯！1、抗體問題，真的是一分錢一分貨一抗用多克隆抗體容易出現非特異性染色，建議用高純度，高效價的針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。單克隆抗體很貴，不過結果真的很好。尤其是背景非特異性染色不會太深。真是一分價錢一分貨。一抗過期也會造成杯具，所以要注意抗體的有效期。2、抗體濃度過高/孵育時間過長

發高分 SCI，不會免疫組化（IHC）怎么行？2021/09/07

相信大家對IHC一定不陌生，世界那么大，實驗方法層出不窮，但是免疫組化卻是經典中的經典，想看看別的高大上的技術？不急，我們先來復習復習免疫組化。免疫組化，免疫組織化學技術（immunohistochemistry），是一項利用抗原抗體反應，通過使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原，對蛋白定位，定性的實驗技術。免疫組化主要用的是組織標本和細胞標本兩大類，組織標本包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片。石蠟切片，對組織形態保存好，保存時間也長，雖然對組織抗原暴露有影響，但可以抗原修復，所