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三重四極桿液質聯用測定人血清中的三種甲狀腺激素
閱讀：801 發布時間：2022-7-20前言：許多臨床研究實驗室都非常關注甲狀腺激素水平的測定。甲狀腺素（3,5,3’,5’-四碘甲狀腺原氨酸，又稱 T4）是甲狀腺激素活性更強形式的三碘甲狀腺原氨酸（3,3’,5-三碘甲狀腺原氨酸，又稱 T3）的前體。反三碘甲狀腺原氨酸（3,3’,5’-三碘甲狀腺原氨酸，又稱 rT3）則是甲狀腺激素的非活性形式（圖 1）。在血液中循環的大多數甲狀腺激素都與轉運蛋白相結合。只有非常少量的循環甲狀腺激素是游離（非結合）狀態的，具有生物活性。因此，測定極低濃度的這三種游離甲狀腺激素對了解其在人體中的作用非常重要。本應用簡報報導了將 1290 Infinity 液相色譜系統與配置 AJS 技術的 6490 三重四極桿液質聯用系統聯用，采用正離子電離模式建立了高靈敏度、準確測定血清中游離和總甲狀腺激素的方法。該方法采用串聯質譜 (MS/MS) 和多反應監測 (MRM)，在 0.5 到 1000 pg/mL 范圍內線性良好，游離甲狀腺激素的定量下限 (LLOQ) 范圍為 1 到5 pg/mL，總甲狀腺激素為 0.5 到2.5 pg/mL。
實驗部分試劑和標樣用 50:50 甲醇:30% 氫氧化銨配制 T4、T3、rT3及其13C標記的內標（購自IsoSciences）10 µg/mL 儲備液。于 –20 °C 下保存。用甲醇稀釋儲備液來配制工作溶液。使用加入超低量激素和類固醇的血清（購自Golden West Biologics）與不同量的儲備液配制濃度范圍 0.5 到 1000 pg/mL 的校正標準液。5 ng/mL 標記的內標混合液用甲醇配制。標準參比物 (SRM 971) 購自美國國家標準與技術研究院 (NIST)。
儀器本方法采用 Agilent 1290 Infinity 液相色譜系統與 Agilent 6490 三重四極桿液質聯用系統建立，后者配置 AJS，采用正離子模式。表 1 列出了儀器條件，6490 三重四極桿液質聯用系統的采集參數見表 2。
樣品前處理測定游離甲狀腺激素所用的校正溶液和標準參比物樣品通過 Amicon CentrifugeYM-30 過濾器制得。將 500 µL 血清放入Amicon Centrifuge YM-30 過濾器中，高轉速下離心 2 小時。將 300 µL 濾液轉移至干凈的微量離心管中，加入 30 µL 內標，然后進行渦旋混合。加入 300 µL 乙腈，渦旋混合 1 分鐘，然后高轉速離心10 分鐘。將上清液轉移至 96 孔板中。對這些樣品分別用醋酸乙酯進行液液萃取(LLE) 測定總甲狀腺激素。取 200 µL 樣品置于試管中，加入 20 µL 內標和 400 µL乙腈，然后進行渦旋混合。1.2 混合液中加入 1.2 mL 醋酸乙酯，渦旋混合 60 秒。以 13000 rpm 離心該試管 10 分鐘，將有機相轉移到干凈試管中，然后進行蒸發。干燥后的樣品用120 µL 75:25水:乙腈復溶。
結果與討論方法性能由于 MRM transition 技術的普遍使用，T3 和 rT3 的色譜分離也就極為重要。圖 2顯示游離甲狀腺素或總甲狀腺素分析得到的三種形式甲狀腺激素均實現了基線分離。校正曲線線性良好，在 0.5 到 1000 pg/mL范圍內的變異系數 (R2) ≥ 0.990。與總甲狀腺素相比，游離甲狀腺素的 R2 值略高（圖 3）。
方法靈敏度高，游離激素的 LLOQ 范圍為 1 到 5 pg/mL，總甲狀腺素為 0.5 到2.5 pg/mL（表 3）。游離和總甲狀腺激素的色譜圖表明，可以對極低濃度的分析物進行定量測定（圖 4）。
結論建立了同時分析血清中甲狀腺素 (T4)、3,3’,5-三碘甲狀腺原氨酸 (T3) 和 3,3’,5’-三碘甲狀腺原氨酸 (rT3) 的高靈敏度而特異的 LC/MS/MS 方法。測定低 pg/mL表 3. 人血清甲狀腺激素的 LLOQ分析物游離 LLOQ(pg/mL)總 LLOQ(pg/mL)T4 5 1T3 1 0.5rT3 5 2.5水平的游離甲狀腺激素需要進行簡單的過濾前處理，而測定總甲狀腺需要進行液液萃取。
