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液相色譜對肝臟組織提取物中脂質分析的影響
閱讀：918 發布時間：2022-3-7前言：脂質組學屬于新興研究領域，其核心工作是生物系統中各種脂類物質的表征和定量分析。質 譜法是否能夠成功檢測和鑒定出給定樣品中的數千種潛在脂質，將直接取決于脂質液相色譜分離的策略。 肝臟、腦、心臟組織提取物是脂質組學研究中常見的生物樣品。為證明色譜對脂質組學分析 的影響，本應用簡報以肝臟組織提取物為例，總結了使用反相 (RP) 和正相 (NP) 色譜分離不 同類型脂質的優勢。 本研究工作采用 Agilent UHPLC 1290液相色譜系統（包括二元泵、多孔板自動進樣器和柱溫箱）進 行。液相色譜通過安捷倫噴射流接口與 Agilent 6540 Q-TOF 聯用。采用反相和正相色譜兩種 方法分離組織提取物。
• 肝臟總脂質提取物購自 Avanti Polar Lipids 公司（亞拉巴馬州阿拉巴斯 特），脂質成分組成見上圖
• 將凍干的脂質提取物復溶于 2:1 氯仿/ 甲醇溶液，然后用流動相 A 稀釋至 200 ng/µL
• 進樣量 5 µL（含 1 µg 提取物），進 行反相或
分析工作流程中數據分析的第一步是從結果 中提取分子特征，該特征由保留時間和質量 數確定。此特征將化合物的所有特定加合物 和同位素的豐度濃縮為單個化合物的豐度。 分子特征提取由 Agilent MassHunter 定性 分析軟件（版本 B.07.00）通過 Agilent 分 子特征提取器 (MFE) 算法進行，脂質標注 通過 Agilent METLIN 脂質 PCDL (B.07) 和 SimLipid 軟件（版本 4.20，PREMIER Biosoft 公司，加利福尼亞州帕羅奧圖）進 行。METLIN 脂質 PCDL 包含 640 張通過化學標準品獲得的 MS/MS 譜圖。SimLipid 軟件支持脂質譜圖的 MS/MS 理論匹配且包 含 36,224 個脂質條目。
結果與討論 我們采用 MFE 算法對反相色譜法分離的肝 臟脂質提取物進行分析，得到了 4,108 種提 取化合物（特征）。然后我們在 METLIN 數據庫中搜索化合物，得到 1,000 余種帶有 脂質標注的化合物，單次液質聯用分析僅耗 時 38 分鐘（圖 1）。
與基于親脂性（主要由碳鏈長度和雙鍵數確 定）的反相色譜脂質分離相比，正相色譜分 離主要基于脂質頭基的極性。圖 3 表明正相 色譜對于偏極性的脂質和帶電脂質的分離非 常高效。但會流失中性脂質（如甾醇類、二酰甘油類和三酰甘油類），因為使用這類 流動相時中性脂質不能得到色譜保留。對于 能夠檢測到的化合物，用戶可根據已知的脂 質分類特征搜索相應的目標數據庫，從而提 高脂質標注的準確度。例如，我們可以將搜索范圍限制在 PE 脂質中，具體方法有：在 限定的保留時間窗口中查詢洗脫化合物；僅 搜索 METLIN 脂質 PCDL 中 PE 子集下的 PE 條目或進行自定義的 SimLipid 搜索。
表 1 所示為不同數據庫的搜索結果，數據 文件來自相同肝臟組織提取物在不同色譜法 和離子源條件下的分析。我們采用 MFE 算 法處理僅通過四極桿 1 獲取的數據文件。 所得化合物根據 METLIN 脂質 PCDL 標 注，也可以使用 SimLipid 軟件標注。為 實現高準確度的脂質標注，我們也對自動 MS/MS 數據文件進行了 MFE 算法處理， 但只有含 MS/MS 數據的化合物才能用于數 據庫查詢。可使用 METLIN 脂質 PCDL 通 過譜庫匹配標注化合物，也可以使用僅基于 MS/MS 數據的 SimLipid 軟件進行標注。
重點注意：與 METLIN PCDL（通過可靠 化學標準品獲得的高質量專業譜庫）標注不 同，SimLipid 標注是將 MS/MS 譜圖與理 論模擬生成的 MS/MS 碎片譜圖進行匹配。 以上示例表明分析人員可對色譜法進行優化 以用于不同類型脂質的分析，反相和正相液 質聯用系統在脂質組學分析中具有各自的選 擇性優勢。反相液質聯用系統的適用范圍更 加全面，能夠分離多種不同類型的脂質，實 現更多特征的檢測和標注。另外，保留時 間具有很好的重現性，有助于色譜比對和差 異分析工作流程。正相液質聯用系統的優勢 在于能夠根據極性脂類的特征保留行為，對 其進行更高準確度的標注。此外用戶還能夠 迅速通過色譜圖掌握樣品間脂質種類的整體 差異。
結論：本文驗證了色譜法對復雜生物樣品中多種類 型脂質進行全面檢測和分析的能力。我們將 脂質特異 UHPLC 方法與具有寬動態檢測范 圍的精確質量 Q-TOF 聯用，并配合使用先 進的特征查找軟件進行自動化脂質數據庫搜 索，實現了在單次液質聯用分析中檢測和標 注出 1,000 余種脂質。分析人員可對色譜方 法開發進行優化，以靶向分析不同類型的脂 質，如我們使用兩種可選的液相色譜分離方 法 — 反相色譜和正相色譜對肝臟組織提取 物進行的分離所示。從脂質組學分析的角度 來看，這兩種方法具有各自的選擇性優勢， 可使脂質檢測覆蓋更加深入、全面。