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海鮮組織中的獸藥分析-液相色譜與液質聯用
閱讀：752 發布時間：2021-11-21前言：水產養殖是一個不斷增長的全球性行業；預計 2030 年以后全球產量可能超過 93000 噸1 。隨著產量提高而不斷增加的獸藥使用量已成為全球關注的問題。雖然 針對水產養殖用獸藥和非處方抗生素的使用有相應的控制和監管措施，但某些國家 對耐藥性和毒性的擔憂仍在不斷增加。美國食品進口量持續增長，因而愈發需要一 種快速靈敏的篩查技術，用于檢測海鮮中未經批準的水產養殖用獸藥。多家制造商 已經開發出使用酶聯免疫吸附測定法 (ELISA) 來測定獸藥殘留的快速篩查方案。性 能最佳、靈敏度最高的儀器方法當選高效液相色譜 (HPLC) 與串聯質譜（MS/MS 或三重四極桿/MS）聯用系統，該儀器平臺可顯著降低背景信號，還能夠準確定量 測定樣品基質中濃度極低的獸藥2 。 另一方面，Ionsense, Inc. 的實時直接分析質譜 (DART-MS) 有利于對組織制品中的各 類獸藥進行實時實驗室分析，同時省去了典型 HPLC-MS 所需的標準方案和程序。 通常采用費時的 ELISA 試劑盒分析個別的目標獸藥，借助 DART-MS 進行分析可以實 時、同步地檢測多種獸藥類別。
開發如 DART-MS 的離子源技術，以便在 大氣壓/地電位（分子電離至帶電狀態所 消耗的能量）對材料和樣品基質進行 快速、非接觸分析。將揮發性樣品引入到 一個真空源中，在那里與亞穩態原子相反 應而發生電離。該技術誕生于 2005 年， 首先在州和聯邦實驗室中用于篩查人用非 法藥物，并且已通過 HPLC-MS 技術驗證 為確證性方法。它已經有一些成功應用 的示例，包括藥物、代謝物、肽和低聚 糖、合成有機物、有機金屬化合物、濫用 藥、爆炸物和有毒工業化學品等的檢測。 DART-MS 當前用于混凝土、瀝青、人體 皮膚、貨幣、航空公司登機牌、名片、水 果、蔬菜、香料、飲料、體液、園藝樹 葉、雞尾酒杯和服裝等各種表面，它可以 實時地提供瞬間響應，這對于提高通量和 增強分析能力至關重要3 。 三重四極桿MS 技術已得到成功應 用。它以 Agilent iFunnel 技術的高性能為 基礎，其中包括 Agilent 6495 三重四極桿 液質聯用系統，該系統能夠檢測極低濃度 的獸藥。6495 系統將分析靈敏度、動態 范圍、耐用性、精密度和準確度提升至水平4 。本應用簡報介紹了安捷倫技術 iFunnel 與 DART 離子源 的實時分析能力結合的新用途，即，對添 加獸藥混標至海鮮組織中的蝦和魚類海鮮 基質進行分析。
使用 Agilent 6400 系列三重四極桿/MS， 以全面考察 DART 和 HPLC-ESI（電噴霧 離子化）的功能，這是通過 Agilent 1290 HPLC-6495 系統和 DART-6495 系統并行 地分析一系列獸藥來實現（圖 1）。
實驗部分 使用 Agilent 6495 iFunnel（三重四極桿 質譜儀，型號 G6495A）和 Ionsense, Inc. 帶 Vapur 接口的 SVP-DART 對分析物進行 分離。分析九種獸藥的混合標樣（圖 2， Sigma-Aldrich），測定 平臺對 這些組分的定量限、檢測限、線性動態范 圍和分析靈敏度等基準資料。
采用 Agilent Bond Elut 增強型脂質去除產品 (EMR―Lipid) 萃取魚蝦組織。EMR―Lipid dSPE 試劑盒包括分散吸附劑，其被預稱 量置于 15 mL 離心管中（EMR―Lipid，部 件號 5982-1010），還包括經過預包裝的 MgSO4 拋光粉（部件號 5982-0102）。 將大約 15 g 的白蝦 (l. setiferus) 和 5 g 羅 非魚 (Oreochromis spp) 轉移至陶瓷研 缽中，將其*浸軟以裂解組織的細胞 壁。將 2 g 浸軟的組織轉移至 50 mL 聚 丙烯離心管中。在水中制備各個加標化 合物之后（例外：氯霉素使用購自 Fisher Chemical 的 LC/MS 級乙醇進行配置）， 使用去離子水為圖 2 中列出的 9 種藥物 配置混合加標溶液。該混合溶液的加標 濃度為：500 ppb、250 ppb、100 ppb、 50 ppb 和 10 ppb。 組織加標后，靜置樣品 15 分鐘。接著， 將加標組織渦旋混合 30 秒，然后將 10 mL 含 5% 甲酸的乙腈溶液（Fisher Chemical， LC/MS 級）加入離心管中。將離心管渦旋 混合 1 分鐘，并在 4000 rpm 的轉速下離 心 10 分鐘。離心后，另將 5 mL 的 5 mM 乙酸銨加到已預裝分散固相萃取劑的 15 mL 聚丙烯管（部件號 5982-1010）中 渦旋混合 1 分鐘，活化 EMR―Lipid 分散 吸附劑。也可以在后續實驗中使用 18Ω 純水，得到更出色的結果。在分散步驟中 用純水替代乙酸銨的方案將在隨后的文章 中發布。
渦旋混合分散吸附劑和乙酸銨后，立即將 所提取樣品管中的 5 mL 上清液加到包含 分散吸附劑和乙酸銨的離心管中，渦旋 混合 1 分鐘，并在 4000 rpm 的轉速下離 心 10 分鐘。然后將全部萃取液從 EMR― Lipid 離心管中傾析到一個 50 mL 離心管 中，并加入一整袋 MgSO4 拋光粉。先搖 晃該離心管，再渦旋混合 1 分鐘，并在 4000 rpm 的轉速下離心 10 分鐘。然后 將包含 MgSO4 粉末的離心管上層轉移到 干凈的 15 mL 聚丙烯管中，并在 65±5 °C 的水浴上使用 N2 進行吹掃蒸發，直至管 中留有 10 μL 內容物。
將 15 mL 聚丙烯管中的內容物復溶于 100 µL 1:1 的 5 mM 甲酸銨/甲醇（Fisher Chemical，LC/MS 級）中。將管中復溶物 渦旋混合 30 秒。DART QuickStrip 卡的每 個篩查點上用 5 μL 溶液進行點樣。要完 成 HPLC 分析，將 50 µL 復溶溶液轉移至 2 mL 微量離心管中離心 30 秒。隨后，將 30 µL 離心后溶液轉移至帶有聚合物內插 管（部件號 5180-1270）的安捷倫 HPLC 樣品瓶中。圖 3 展示了 Agilent Bond Elut EMR―Lipid dSPE 的流程圖。圖 4 以圖形 方式展示了 Bond Elut 增強型基質去除試 劑盒增強的凈化效果。
……
結果與討論 要校正樣品的基質干擾效應，可通過分析 蝦和魚組織與基質匹配的混合標樣（使用 獸藥標樣加標的組織樣品），確定所檢組 織中獸藥的檢測限。根據第二次分析的 DART 結果（圖 6），所有與基質匹配的 獸藥標樣在濃度為 50 ppb 時均可檢出， 且若干與基質匹配的獸藥還可在濃度低至 1 ppb 時檢出。圖 11 和 12 展示了使用濃 度為 1 ppb 的基質匹配標樣得到的環丙沙 星和氟甲喹的 數據結果。 要校正樣品基質干擾效應，可使用方案分析中的與基質匹配 的混合標樣，確定所檢組織中獸藥的檢測 限。如恩諾沙星示例所示（圖 13），基質 匹配標樣濃度為 10 ppt 時，其中的目標 分析物可輕松檢出。