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隨著分子生物學研究的不斷深入，分子克隆技術也隨之更新迭代，從傳統的依賴限制性內切酶的方法發展到如今的TA克隆、TOPO克隆、無縫克隆等等，新的技術不斷涌現，為分子生物學的發展和進化提供新的力量。
但有時候選擇多，反而讓人頭大！
市面上常用的TOPO克隆與同源重組克隆，到底應該選擇哪一個克隆技術用于自己的實驗呢？今天小翌就來給各位科研er們科普一下二者之間的區別。
原理區別
TOPO克隆技術
基于拓撲異構酶I（Topoisomerase I）的DNA克隆方法，該酶同時具有限制性內切酶活性和連接酶活性，能夠識別特定DNA序列5'-(C/T)CCTT-3'并在此序列上酶切雙鏈DNA，使得Topo酶與3'末端形成共價鍵。在連接反應中，受插入片段的5'端羥基的攻擊，磷酸鍵釋放能量。利用該能量，插入片段5'端羥基與載體片段3'端磷酸基團連接在一起，Topo異構酶從載體分子上脫落，完成連接反應。
TOPO克隆原理
目前市面上的產品，需根據DNA片段末端的不同，選擇不同的TOPO克隆試劑盒。如果高保真酶擴增片段，獲得的片段即為平末端，可以選擇TOPO-Blunt試劑盒（翌圣Cat#10909ES、Cat#10910ES）。如果Taq酶擴增片段，獲得的片段即為粘性末端，可以選擇TOPO-TA試劑盒（翌圣Cat#10907ES、Cat#10908ES）。翌圣新一代兼容型TOPO-TA/Blunt克隆酶（Cat#10906ES），可以無視擴增后片段末端的區別，室溫反應5 min即可連接上TOPO載體，陽性克隆率接近100%。
翌圣兼容型TOPO克隆原理
同源重組克隆技術
基于同源重組酶的定向克隆技術。首先將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應的一致的序列。PCR產物和線性化載體在同源重組酶（T5核酸外切酶切割5’末端形成粘性末端，DNA聚合酶通過15-25 bp的同源序列互補配對，Taq連接酶修復缺口）的作用下，經過一定的時間和溫度即可進行轉化，完成定向克隆。
同源重組原理
同源重組酶可連接單片段或者多片段，根據插入片段數的不同，選擇不同的一步法快速克隆試劑盒。翌圣的Hieff Clone®系列一步法克隆試劑盒，最快僅需50℃反應5 min即可轉化，完成定向克隆，克隆陽性率可達95%以上。其中，翌圣10911ES試劑可連接單片段，該試劑盒已發文章累計IF達到1000+。10923ES試劑可連接1-7片段，最長連接片段可達27 kb，是多片段連接。值得注意的是，同源重組技術同樣可以無視擴增后片段末端的區別，直接進行載體、片段連接。
翌圣單/多片段克隆連接原理
實驗步驟區別
TOPO克隆
翌圣Hieff Clone® TOPO克隆系列試劑，僅需添加100 bp-5 kb目的片段，室溫反應5 min，即可完成克隆，且無需藍白斑篩選。
同源重組克隆
翌圣Hieff Clone®一步法克隆系列試劑，僅需添加線性化載體、目的片段，50℃反應5-50 min，即可完成1-7片段的一步克隆。
那么兩種克隆技術都是載體和片段的連接，應該如果選擇呢？
小翌建議大家可以根據應用場景的不同，選擇不同的克隆試劑盒。
TOPO克隆
片段保存：進行長片段或復雜模板的載體構建時，可以先將插入片段亞克隆至TOPO載體上，將插入片段進行穩定的保存，方便進行后續的分子操作。
測序：對目的片段進行一代測序時，可以將目的片段克隆至TOPO載體上，送去測序，相對于PCR產物直接測序，送質粒測序結果更加準確，測序更加完整。
表達載體構建：通過構建表達載體在宿主細胞中表達目標基因，以研究基因的功能或生產特定的蛋白質。
定點突變：在特定位置引入預定的基因序列改變，如單個堿基的替換、插入或刪除。用于研究基因的特定功能域、蛋白質的結構-功能關系、疾病相關基因的研究等。
多片段克隆：同時將多個DNA片段克隆到一個載體中，構建復雜的基因表達載體或進行基因組編輯，用于構建復雜的基因表達系統。
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克隆實驗流程 | 產品定位 | 名稱 | 貨號 | 規格 |
載體、片段制備 | 高保真PCR | 2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye) | 10164ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
目的片段保存、測序 | TOPO克隆-兼容TA/平末端 | Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 10906ES20 | 20 T |
同源重組 | 1-7片段一步法定向連接，最快5分鐘完成重組反應 | Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit | 10923ES20/50 | 20 T/50 T |
轉化 | 5 min快速完成感受態轉化 | F DH5α化學感受態 | 11803ES80 | 10×100 μL |
菌落PCR | 快速PCR升級，可菌P且適用復雜模板擴增 | 2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix | 10167ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
