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疫苗是將病原微生物（如細菌、病毒等）及其代謝產物，經過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預防傳染病的自動免疫制劑。自1798年英國醫生琴納研發牛痘疫苗以來，疫苗作為預防性藥物，在患病之前給予人體抵御疾病的能力，比治療性藥物意義更加重大。早期疫苗大多預防的是嚴重的、流行度高的傳染性疾病，例如牛痘疫苗預防的天花曾經在1900-1908年間在全球殺死5億人，十四世紀的鼠疫曾經導致歐洲三分之一的人口死亡。疫苗的出現，終結了這種毀滅性的災難，將人類從生存威脅中解放出來，功不可沒。

根據Statista統計數據，2023年中國疫苗市場規模為1017.7億元，其中非免疫規劃疫苗市場規模973.6億元，在疫苗市場占比95.67%；免疫規劃疫苗市場規模44.1億元，占比4.33%。這意味著疫苗市場規模邁入千億門檻，已超越不少傳統大適應證治療用藥的市場規模。

疫苗的種類多樣，分類方法也有多種。按國家標準，可以分為一類疫苗（免疫規劃疫苗，政府免費提供并且公民必須接種，如乙肝疫苗、卡介苗等））和二類疫苗（非免疫規劃疫苗，公民自愿接種且費用自行承擔，如HPV疫苗、流感疫苗等）。按照制備工藝，可以分為減毒活疫苗、滅活疫苗、類毒素疫苗、多糖疫苗、多糖蛋白（結合）疫苗、重組蛋白疫苗、核酸疫苗和病毒載體疫苗等。

疫苗從早期研發到獲批上市需要經歷多個階段，每個階段都存在極其復雜的不確定性，需要對其中多個關鍵點進行嚴格的質量控制，從而確保最終產品的安全性和有效性。

圖1.疫苗研發及生產流程中翌圣質控產品推薦

去除宿主細胞雜質是細胞基因治療藥物在內的生物制藥產品生產中的關鍵步驟，其中宿主細胞殘留DNA由于可能存在的免疫原性、感染性以及致瘤性等安全問題成為關鍵質控指標。在此情況下，建立合適的檢測方法監測生產工藝，控制宿主細胞殘留核酸限度，以確保產品的安全性和質量已經成為監管機構和行業內關注的重點。

• 《中國藥典》2020年版三部規定，以細胞基質生產的生物制劑外源宿主細胞DNA殘留量不能超過100pg/劑，以細菌或真菌基質（酵母、大腸桿菌等）表達的生物制品中DNA殘留量不超過10ng/劑；

• 《歐洲藥典》（EP10.0）通則規定的生物制品殘留DNA限度大多為不超過10ng/劑；

• 美國食品藥品監督管理局（FDA）發布的指導原則中指出生物制品宿主細胞DNA殘留限度不得超過100pg/劑，對于大劑量的生物制品（如單克隆抗體），根據其殘留DNA來源及給藥途徑，DNA殘留量可放寬至10ng/劑。

此外，《中華人民共和國藥典》2020年版第三部規定，外源性DNA殘留檢測采用DNA探針雜交法、熒光染色法和定量PCR法。目前市場上對宿主細胞殘留DNA檢測，主要采用熒光探針qPCR方法，qPCR法具有高的靈敏度、序列特異性和準確性，可為生物制藥工業在工藝研究和成品質量控制方面提供可靠的檢測手段，現也已成為各生物制品廠家檢測方法。

翌圣生物自主研發的CHO宿主細胞殘留DNA的qPCR法檢測試劑盒，可快速高效檢測生物藥中宿主DNA殘留量。

圖3. CHO DNA (3G)標曲范圍3fg/μL~300pg/μL，擴增效率為99.29%，各濃度檢測值CV<15%

除需對DNA的殘留量進行控制外，DNA殘留片段大小分布也是確定其相關風險因素的重要指標。有研究表明，一個功能基因至少在200bp以上，因此大于200bp可能會有一定的致病性，且殘留DNA片段越大，生物制品的風險等級越高。

美國FDA在《Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs)》的行業指南中建議將非致瘤性連續細胞的殘留DNA量限制在10 ng/劑以下，DNA大小限制在約200bp以下。

2022年5月，國家藥品監督管理局藥品評審中心（CDE）發布的體內基因治療產品要學研究與評價技術指導原則（試行）中也明確指出需對DNA殘留量和殘留片段大小進行控制，建議盡量將DNA殘留片段的大小控制在200bp以下。

目前，行業內對于殘留宿主細胞DNA片段分析，主要是利用毛細管電泳的方法。研究者們開發了一種基于毛細管凝膠電泳與敏感激光誘導熒光（CGE-LIF）檢測殘留DNA分子大小的方法，可以檢測生物制品中殘留DNA的大小，實驗表明，大多數宿主細胞殘留DNA片段大小為50～2 000bp。除了毛細管電泳法外，實時熒光定量PCR（qPCR）法也被用于進行生物制品中生產用細胞相關的DNA片段分布的分析。且qPCR法相比于CGE-LIF操作更簡單，耗時更短。

針對上述情況，翌圣生物自主研發了CHO&Vero殘留DNA片段分析試劑盒，采用熒光探針qPCR法原理，設計了四種不同的擴增片段（幾十bp、100多bp、200多bp、500多bp），用于定量檢測樣本中宿主細胞殘留DNA片段的大小分布情況。

圖4. 宿主細胞中殘留DNA片段分析檢測流程圖

生物制品中HCP殘留含量通常被認為是產品的關鍵質量屬性(CQA)，是工藝穩健性監測的重要評價指標，也是產品的重要質控指標。各國法規都有涉及HCP的論述，要求必須對生物藥品進行分析和純化，以將宿主細胞蛋白HCP降低到可接受的水平。

酶聯免疫吸附法（ELISA）是目前HCP檢測常用的方法，在2020版《中國藥典》通則3412/3413/3414中提到的宿主蛋白殘留檢測方法均為ELISA法。

翌圣生物科技（上海）股份有限公司自主研發了包括CHO和畢赤酵母宿主細胞在內的多款HCP蛋白殘留量檢測試劑盒。試劑盒均采用雙抗夾心酶聯免疫檢測（ELISA）的實驗原理，以及生物素-鏈霉親和素放大系統，能夠高靈敏的檢測樣本中HCP殘留量。試劑盒可以用于生物制品純化工藝過程的優化、中間工藝過程的雜質控制以及終產品的放行檢測。

圖5. 翌圣CHO和畢赤酵母HCP ELISA試劑盒產品特點

生物制品生產中經常會涉及到細胞培養或組織培養，在這些培養中胎牛血清被廣泛應用，為細胞生長提供必須的營養成分，而胎牛血清中就包含了一定量的BSA（Bovine serum albumin，牛血清白蛋白）。考慮到生產的藥物的安全性，目前疫苗、抗體藥物、組織工程產品以及細胞&GCT等生物制品的生產過程中，逐漸使用無血清培養基來替代含血清培養基，從而減少可能由血清帶來的病毒污染等潛在危害。其中，無血清培養基多采用各種可以替代血清功能的生物大分子配制而成，例如牛血清白蛋白（BSA）、轉鐵蛋白和胰島素。由此，無論使用含血清培養基還是無血清培養基，都會有BSA。雖然在生產中經過純化等步驟去除了大部分的雜質蛋白，但仍然會有微量的外源蛋白（如BSA等）存在于最終的生物制品中。

BSA作為外源蛋白進入人體后可能引起嚴重過敏反應，從而影響生物制品的安全性。2020版《中國藥典》（三部）對各種疫苗中BSA的殘留量進行了明確規定，基本是不高于50 ng/mL或者不高于50 ng/劑。

翌圣生物依托相關法規，從市場需求出發，自主研發了牛血清白蛋白（BSA）殘留量檢測試劑盒。試劑盒采用雙抗夾心酶聯免疫檢測（ELISA）的實驗原理，以及辣根過氧化物酶（HRP）信號放大系統，能夠高靈敏的檢測樣本中牛血清白蛋白殘留量。試劑盒可以用于生物制品純化工藝過程的優化、中間工藝過程的雜質控制以及終產品的放行檢測。

表1. 翌圣BSA ELISA試劑盒產品性能參數

金黃色葡萄球菌細胞壁中的A蛋白（Staphylococal ProteinA，SPA）又稱Protein A，是一種金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白質，42kDa，能特異性地與人和哺乳動物抗體（主要是IgG）的Fc區結合，通常在大規模抗體制備中用于純化IgG。在抗體藥生產中，下游親和層析過程中Protein A會不可避免的與目標抗體蛋白一起被洗脫下來，從而在最終純化步驟中產生Protein A殘留。這種雜質會嚴重影響產品質量、藥效以及安全性。因此，國內外法規對殘留Protein A檢測以及殘留量標準均有相關文件出臺。

《中華人民共和國藥典》2020年版第三部《人用重組單克隆抗體制品總論》3.2.4 工藝相關雜質中提出“采用適宜的方法對供試品宿主蛋白質、宿主細胞和載體DNA、蛋白A及其他工藝相關雜質進行檢測"。

USP<130> PROTEIN A QUALITY ATTRIBUTES中提到希望廠家能夠在純化工藝中將脫落的protein A清除，生產工藝也需要進行相應驗證。

關于Protein A檢測方法和殘留限度，2020年版中國藥典三部《尼妥珠單抗注射液》3.1.3.3 蛋白質A殘留量中提出“用酶聯免疫吸附法（通則3429）測定，蛋白質A殘留量應不高于蛋白質總量的0.001%"。

目前，基于ELISA的殘留檢測基本上已被應用于工藝研發和驗證過程中以確保在蛋白A親和層析之后的過程步驟中能夠有效去除殘留蛋白A。翌圣自主研發的Protein A ELISA Kit正是采用ELISA方法，通過試劑盒中的標準品對樣品中的殘留protein A進行定量檢測。

圖6. 翌圣生物ELISA法檢測Protein A殘留量的實驗過程

在治療性藥物（如抗體、病毒載體藥物、疫苗等）的生產及工藝流程中，核酸雜質的去除至關重要。UltraNuclease全能核酸酶，又稱為廣譜核酸酶、非限制性核酸內切酶，其能夠在多種實驗條件下切割和降解各種形式的DNA和RNA，廣泛用于去除生物制品中的核酸。

在正常的純化步驟中，全能核酸酶作為雜質很容易被去除。為檢測全能核酸酶具體殘留量，行業內常采用UltraNuclease作為標準品，開發與之配套的ELISA試劑盒。

翌圣自主研發的UCF.ME® UltraNuclease ELISA Kit正是采用雙抗體夾心酶聯免疫檢測（夾心ELISA）原理，能夠準確檢測樣本中全能核酸酶的殘留量，該試劑盒在線性、重復性、回收率及特異性等方面均表現穩定。

圖7. 翌圣核酸酶ELISA試劑盒實驗原理（雙抗夾心ELISA法）