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核酸提取總是出問題？別怕，答案在這
核酸作為一切分子生物學研究的基礎，其提取通常是開啟生物學研究的第一步，而且提取的核酸質量高低也是決定下游實驗成敗的關鍵因素之一。
圖片來源：pixabay
小翌總結一些現用核酸提取過程中的常見問題。
1.A260/280比值較低？或者A260/280比值較高？
2.提取的細菌基因組DNA有降解，為什么？
確認選用的培養菌體是否新鮮，如果菌體需要保存時，請于-80℃保存。
起始菌液量過多，導致菌液裂解不充分，部分DNA降解。
菌體本身富含DNA酶活性，加入Digestion solution后再加20uL0.5M EDTA溶液來抑制內源性核酸酶
3.提取的基因組DNA生物活性差，為什么？
提取的基因組DNA中鹽分濃度過高，請嚴格按照說明書操作。
提取的基因組DNA中含有乙醇。離心的速度和時間應該嚴格遵循說明書要求進行。
4.堿裂解法提取的質粒DNA進行瓊脂糖電泳進行鑒定時，看到的三條帶分別是什么？
堿法抽提得到質粒樣品中不含線性DNA，得到的三條帶是以電泳速度的快慢排序的，分別是超螺旋、開環和復制中間體（即沒有復制*的兩個質粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。
5. 為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊醇？
在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數次，這時在混合液內易產生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產生。一般采用氯仿與異戊醇為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24：1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定。
1.凍存細胞與新鮮細胞的RNA提取有區別嗎？具體該怎么操作？
2.RNA得率低
該組織或者細胞中RNA含量偏低：不同細胞和組織中RNA的豐度不同，如肝臟，胰腺，心臟等是高豐度組織(總RNA含量2-4μg/mg)，腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢等是中豐度組織(總RNA含量0.05-2μg/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低豐度組織(總RNA含量<0.05μg/mg)。
組織起始量太少或者太多：樣品量過少，則細胞組織中RNA含量較低；樣品量過多則可能超過裂解液的裂解能力，裂解將不*，從而導致RNA得率低。
提取的材料不新鮮。新鮮組織取得后應立即置于液氮中或立即放入RNAstore試劑中，以保證提取效果。
處理樣品量過大。
污染了RNase。雖然試劑盒中提供的緩沖液都不含RNase，但使用過程中很容易污染RNase，應小心操作。
4.OD260/OD280比值偏低
蛋白質污染：確保不要吸入中間層及有機相。減少起始樣品量，確保裂解*、*。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，則用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。
苯酚殘留：確保不要吸入中間層及有機相。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。
多糖或多酚的殘留：一些特殊的組織和植物中，多糖、多酚含量較多，這些殘留也會導致OD260/OD280比值偏低。因此，從這類材料中提取RNA時，需要注意多糖、多酚雜質的去除。
設備限制：測定OD260及OD280數值時，要使OD260讀數在0.1-0.5之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測OD值時，對照及樣品稀釋液請使用10mM Tris，pH7.5。用水作為稀釋液將導致比值偏低。
5.RNA 中有基因組DNA污染
材料中核酸含量高：脾臟、胸腺等組織中的核酸含量較高，可進行多次酚 / 氯仿抽。
提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 處理，降解 DNA。
材料過量：增加試劑用量。
RNA 沉淀條件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時，加入的異丙醇與提取液的比例偏高。
溶液的 pH 值偏小，都容易使 DNA 形成沉淀。
本次的分享就到這里，如果大家在核酸提取過程中遇到問題，歡迎到文章底部留言哦，專業的技術人員會解答您的疑問。
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