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手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列：如何正確選擇逆轉錄引物？
通過上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲線系列：逆轉錄酶，你真的了解嗎？》一文的學習，相信大家對逆轉錄酶有了一定的了解，但選對了逆轉錄酶并不意味著你的逆轉錄實驗就大功告成，逆轉錄引物的正確選擇也是重要一環。根據不同實驗目的，逆轉錄引物的選擇也是大相徑庭。接下來，小翌與大家一同學習下逆轉錄引物的相關知識，學會如何正確選擇逆轉錄引物。
PART 01
逆轉錄引物介紹
1
Oligo（dT）
2
隨機引物
3
基因特異性引物
PART 02
逆轉錄引物優劣勢比較
引物類型 | 結合部位 | 優點 | 缺點 |
Oligo(dT) | 真核生物mRNA3’端poly(A)尾 | 可合成全長cDNA | 1、僅擴增有polyA尾的mRNA 2、對模板質量要求高 |
隨機引物 | RNA的許多隨機可結合部位 | 適合復雜結構和微量模板 | 特異性低，小片段多 |
基因特異性引物 | 特異性互補序列 | 特異性強，靈敏度高 | 僅合成特定的序列 |
PART 03
逆轉錄引物的選擇
RNA類型：
1、真核生物mRNA
2、miRNA、核糖體RNA和tRNA等小RNA前體加A尾處理后的模板
Oligo(dT)
1、真核生物mRNA含有poly(A)尾，可以Oligo(dT)引物結合
2、miRNA、rRNA和tRNA本身無A尾，故需要人工處理后才能與Oligo(dT)引物結合
RNA類型：
1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等無3’端poly(A)尾的模板
2、長度比較長、有二級結構存在及微量樣本的模板
隨機引物
隨機引物可以在任意位點和RNA結合并開始反轉
RNA類型：
1、已知基因序列的模板
2、miRNA增加莖環結構的模板
基因特異性引物
1、針對特定序列設計的反轉錄引物
2、miRNA（莖環法）的反轉錄，需要根據基因序列設計對應的引物
【注】:為提高反轉錄效率，并保障獲得更加完整的cDNA，建議將Oligo(dT)和隨機引物混合使用。
PART 04
精品推薦
為方便大家對逆轉錄引物的選擇，翌圣生物通過基因工程技術開發出Hifair® III系列逆轉錄試劑盒，包括兩種引物形式：單獨成管的oligo(dT)、random primer和按比例預混的oligo(dT)、random primer。其中，按比例預混的引物僅適用與qPCR實驗中。
RNA類型 | 引物選擇 | 原因 |
1、真核生物mRNA 2、miRNA、核糖體RNA和tRNA等小RNA前體加A尾處理后的模板 | Oligo(dT) | 1、真核生物mRNA含有poly(A)尾，可以Oligo(dT)引物結合 2、miRNA、rRNA和tRNA本身無A尾，故需要人工處理后才能與Oligo(dT)引物結合 |
1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等無3’端poly(A)尾的模板 2、長度比較長、有二級結構存在及微量樣本的模板 | 隨機引物 | 隨機引物可以在任意位點和RNA結合并開始反轉。 |
1、已知基因序列的模板 2、miRNA增加莖環結構的模板 | 基因特異性引物 | 1、針對特定序列設計的反轉錄引物 2、miRNA（莖環法）的反轉錄，需要根據基因序列設計對應的引物 |
PART 05
Hifair® Ⅲ 系列逆轉錄酶性能展示
可耐受60℃反應溫度，適合具有復雜二級結構的RNA模板的逆轉錄
圖1. 以500 ng 293T細胞的總RNA為模板, 使用Hifair® Ⅲ逆轉錄酶 (Cat .11139ES) 在42℃-65℃下進行逆轉錄。取1 μL cDNA為模板, 使用Hieff® Canace Gold 高保真酶 (Cat .10148ES)擴增TFRC基因（4.4kb）。M:1 kb DNA ladder.
圖2. 以500 ng 293T細胞的總RNA為模板，oligo dT為引物，使用Hifair®Ⅲ逆轉錄酶 (Cat .11139ES)合成cDNA。取1 μL cDNA為模板，使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat .10148ES)擴增DY1C1N1基因（19.9 kb）5’端的500 bp。M: 1 kb DNA ladder.
線性檢測范圍廣，Total RNA 10 pg-5 μg
圖3. 以10 pg-5 μg的293T細胞的總RNA為模板，使用Hifair®Ⅲ逆轉錄酶預混液 (Cat .11141ES)合成cDNA。取1 μL cDNA為模板，使用Hieff UNICON® Power qPCR 預混液 (Cat 11195ES)擴增PTTG1基因。
PART 06
相關產品
產品定位 | 產品名稱 | 貨號 |
單酶 | Hifair®II Reverse Transcriptase | 11110ES92/93 |
高靈敏度單酶 | Hifair® III Reverse Transcriptase | 11111ES92/93 |
Kit | Hifair®II 1st Strand cDNA Synthesis Kit | 11119ES60 |
Kit(含gDNA去除步驟) | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) | 11121ES60 |
高靈敏Kit（含gDNA去除步驟） | Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) | 11139ES60 |
預混液 | Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix | 11120ES60 |
預混液（含gDNA去除步驟） | Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11123ES60 |
高靈敏預混液（含gDNA去除步驟） | Hifair® III1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | 11141ES60 |
PART 07
翌圣逆轉錄產品已發表文獻（部分）
[1] Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innateimmunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.（IF31.398）
[2] Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2and pangolin coronavirus in vitro[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2020, 5(1): 1-3. (IF13.493)
[3] Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotescell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.（IF 12.353）
[4] Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters, 2020.（IF12.279）
[5] Xu L, Xu S, Sun L, et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle[J]. Microbiome, 2021, 9(1). (IF 11.607)
以上是小翌本期給大家分享的內容，主要介紹了逆轉錄引物的種類、優缺點和選擇應用。下期，我們將給大家分享逆轉錄實驗中的一些注意事項，我們下期不見不散哦~
最后就是小翌發福利的時候啦，掃描以下二維碼填寫表單，即可免費申請逆轉錄系列產品試用裝哦~
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