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雙螢光素酶報告基因檢測系統~實驗操作篇

2021-10-12　　閱讀(371)

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雙螢光素酶報告基因檢測系統~實驗操作篇



自1990年螢光素酶生物傳感器技術誕生以來，單螢光素酶檢測系統到雙螢光素酶檢測系統的發展，為科研人員提供了更為嚴謹的實驗手段。雙螢光素酶報告基因檢測系統在單報告基因的基礎上引入了“內參對照"報告基因，可以排除不同組之間細胞生長狀況、細胞數目以及轉染效率帶來的干擾，起到校正的作用，從而使實驗結果更為可靠。今天小翌將從雙螢光素酶報告基因檢測系統的原理與應用開篇，給大家分享雙螢光素酶報告基因檢測系統的實驗操作流程。

一

雙螢光素酶報告基因檢測系統原理



螢火蟲螢光素酶是一種胞內蛋白，大小為61KDa。在氧氣、ATP和鎂離子同時存在的條件下，催化底物螢火蟲螢光素氧化，生成氧化螢光素，并發出黃綠色光，其*發光波長為560nm。



海腎螢光素酶也是一種胞內蛋白，大小為36KDa。只需要氧氣就可以催化腔腸素，氧化生成高能產物coelenteramide，并發出藍光，其*發光波長為465nm。


海腎熒光素酶.jpg




二

雙螢光素酶報告基因檢測系統應用

◆ microRNA研究

在報告基因的3'端加上目的基因的3'UTR，就能用來檢測miRNA對于目的基因的調控（抑制作用），報告基因表達越少，說明miRNA的作用就越強。

◆ 轉錄調控研究

在報告基因的5'端加上待檢測基因的啟動子，就可以用來檢測轉錄因子對啟動子的作用，啟動轉錄越多，那報告基因的表達量就越大，熒光值越高。

◆ 啟動子研究

將啟動子區域序列進行分段截短，或對特定位點進行突變，再分別構建到luciferase報告載體中，檢測其啟動子活性。

◆ 信號通路研究

信號通路的激活/監測基因的表達水平。


......




三

雙螢光素酶報告基因檢測實驗操作流程



報告基因檢測流程主要有4個模塊：分別是質粒構建、細胞轉染、報告基因檢測和數據分析。



質粒構建


雙螢光素酶報告基因系統一般將螢火蟲螢光素酶報告基因質粒和海腎螢光素酶報告基因質粒共轉染細胞，或將這兩個報告基因構建到同一個骨架質粒上（如pGL4質粒），分別用不同的啟動子啟動其表達。


◆ 主報告基因載體的選擇

根據實驗目的選擇對應的載體骨架。

如果是基因調控研究，需要選擇不帶啟動子或其他調控元件的骨架載體。如果研究啟動子強弱或轉錄因子對啟動子的作用，那么就在該螢光素酶的5'端加上待檢測啟動子序列或者有轉錄因子結合位點的啟動子（下圖左）。如果想檢測miRNA對于目的基因的抑制作用，就可以在螢光素酶3'端加上目的基因的3'UTR（下圖右）。


3'UTR-1.jpg

3'UTR-2.jpg


◆ 內參報告基因載體的選擇

帶有表達組成型啟動子的螢光素酶表達載體作為內參。

不同的載體帶有的啟動子不同，通常啟力：CMV＞SV40＞PGK＞TK。通常內參基因表達的活性應當顯著的高于背景組，同時，盡量小，確保不干擾主報告基因的表達。所以一般選擇內參載體時，首先考慮活性較弱的TK啟動子載體，如果表達量過低，再考慮其他類型的啟動子或者構建自己需要特殊的啟子。



細胞轉染


◆ 轉染細胞系選擇

根據不同細胞系大小和生長速度選擇初始密度（混合度在80-90%）。

◆ 轉染方法選擇

根據實驗目的選擇瞬時轉染和穩定轉染。對于短期表達的目的基因產物，可以選用瞬時轉染法，操作更為簡便。對于需要長期穩定表達目的基因產物，建議選用穩定轉染法，穩定性更好。

◆ 轉染報告基因比例

主報告基因：內參報告基因=10:1-100:1。

◆ 啟動子和轉錄因子比例

啟動子和轉錄因子比例一般為1:9。

◆ 核酸與轉染試劑的比例

從1:2開始調整，另外，注意質粒的純度、完整度和去內毒素。





報告基因檢測


◆ 檢測試劑選擇


◆ 檢測板選擇



◆ 檢測儀器選擇


檢測儀器：發光檢測儀（Luminometer），或帶有發光檢測模塊的多功能酶標儀。
發光模式：化學發光（Luminescence）。
檢測類別：終點法檢測。
波長范圍：無需設置波長，如需選擇，推薦全波長380-780 nm。
注：只選擇在最大波長處檢測發光，過濾掉其他發光信號，意味著檢測會丟掉很多信號，丟失靈敏度。
讀取模式：底讀或頂讀。

檢測時間：輝光型0.5-1 sec，閃光型2-10 sec。





數據分析


通過儀器可以直接讀出螢火蟲和海腎螢光素酶的數值，兩種熒光值讀數不少于4位數，讀數大于8位數時，需要稀釋裂解上清（讀數與細胞種類、細胞狀態、轉染方法、轉染時間等因素相關）。

相對表達倍數具體計算公式如下：

歸一化值=螢火蟲螢光素酶讀值（主報告基因）/海腎螢光素酶讀值（內參基因）

相對表達倍數=實驗組歸一化值/對照組歸一化值

給大家舉個例子：

分類

F-Luc

R-Luc

歸一化（F/R)

平均值

相對表

達倍數

對照組1

20118

50201

0.400748989

0.420043613

1

對照組2

18919

48091

0.393400012

對照組3

21910

47019

0.465981837

實驗組1

60129

60911

0.987161596

1.226184349

2.919183

實驗組2

87927

56873

1.546023596

實驗組3

78791

68791

1.145367853

通過計算以上公式計算，實驗組表達量是對照組的2.92倍。

寫到這里，雙螢光素酶報告基因檢測系統的實驗操作篇就給大家分享完了，大家對這個實驗是否有更進一步的了解啦！如果您在實驗操作過程中還有其他問題歡迎留言哦~


下期小翌將會結合大家的留言進一步分享~


最后小翌給大家分享一下Yeasen螢光素酶報告基因檢測的解決方案，每一步都能幫到您！









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