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前言：免疫療法是目前腫瘤治療領域///具前景的發展方向之一，越來越多的研究靶點進入CAR-T療法的臨床實驗。但這類細胞療法在部分患者中療效短暫、無法應對實體瘤等問題依然困擾著科學家們。要實現CAR-T細胞更廣泛的治療應用，就必須在多個層面進行設計和控制，進而提高療效和安全性。
一、什么是CAR-T療法？
CAR-T(Chimeric antigen receptor T cell)療法：是指通過基因改造技術，使患者 T 淋巴細胞表達嵌合抗原受體，進而能特異性識別、結合腫瘤相關抗原靶點，并同時激活 T 淋巴細胞使其大量增殖活化，從而達到有效殺傷腫瘤細胞的效果，還可形成免疫記憶T細胞，從而獲得特異性的抗腫瘤長效機制。
CAR-T的結構
CAR的結構包括胞外區、鉸鏈區、跨膜區和胞內信號肽區。胞外區主要是抗原特異性單克隆抗體單鏈可變區序列，包括重鏈可變區和輕鏈可變區，二者以鉸鏈連接。其主要作用是以非MHC（Major histocompatibility complex，主要組織相容性復合體）限制性的方式特異性識別靶細胞/腫瘤細胞表面的抗原，向胞內傳遞T細胞活化信號。鉸鏈區使得嵌合抗原受體更加靈活，促進抗原受體與腫瘤抗原的結合；跨膜區是CD4、CD8、CD28等跨膜蛋白分子，起到輔助傳遞T細胞活化信號的作用；胞內信號肽區主要是Ｔ細胞受TCR/CD3ζ 鏈，負責向胞內傳遞第—活化信號。活化的 T細胞大量增殖，并通過分泌顆粒酶、穿孔素、IFN-γ 和 TNF-α等細胞因子直接殺傷靶點腫瘤細胞。
（圖源：CAR-T design: Elements and their synergistic function）
二、CAR-T療法的技術演變
第—代CAR
1989年，以色利化學家和免疫學家Zelig Eshhar和他的團隊設計出了第—個 CAR-T細胞。第—代的CAR胞內只有CD3ζ，在細胞擴增、體內存活時間、以及細胞因子分泌等方面能力有限，使用率比較低，在腫瘤細胞的治療中的效果并不好。
第二代CAR
2002 年，紀念斯隆·凱特琳癌癥中心的Michel Sadelain團隊，在CAR結構中引入了CD28共刺激因子，對提高初始T細胞獲得持久的體外增殖和較強的細胞因子分泌起到了很好的效果，在臨床試驗中顯著改善了CAR-T免疫活性激活的問題，并提高了其作用持久性。2004年，共刺激因子4-1BB被發現也能起到激活T細胞的作用。第二代CAR在目前的研究中運用///廣泛。
第三代CAR
2012年，研究者們在CAR結構中引入2個共刺激因子，相比于第二代CAR來說，第三代CAR在一些前臨床試驗數據中表現出更強更持久的作用活性，但也有報道指出，三代CAR可能會造成T細胞刺激閾值的降低，引起信號泄露，可能誘發細胞因子過量釋放。
第四代CAR
四代CAR-T細胞又被稱為TRUCK T細胞 ( T-cells redirected for universal cytokine killing )，其在CAR-T細胞中引入了一個細胞因子（主要是IL-12），從而修飾腫瘤微環境，募集并活化其他免疫細胞進行免疫反應。
(圖源：AACR)
三、CAＲ-T療法的治療流程
1）細胞分離：血細胞分離機采集腫瘤患者血液中的單個核細胞（PBMC）；
2）T細胞的激活：冷鏈運輸到GMP標準的細胞實驗室內分離并激活PBMC中的T細胞；
3）基因修飾：構建攜帶CAR的慢病毒載體，轉入T細胞中，繼續培養擴增至治療所需劑量；
4）質量檢測：CAR-T細胞經檢測合格后，冷鏈運輸到醫院通過靜脈回輸至患者體內；
5）監控：觀察療效并嚴密監測不良反應，整個療程持續3個星期左右。
(圖源：AACR)
四、影響CAＲ-T臨床療效的因素
雖然CAR-T療法已取得一定進步，但在體內增殖、持續性、腫瘤識別和殺傷能力、安全性與克服副作用等方面，還需要持續完善。
1、CAＲ的分子結構設計
共刺激分子胞內區的嵌入的功能區會影響CAＲ-T的體內活性和持續性。研究表明在CAＲ結構中嵌入CD28能顯著改善一代CAＲ-T在B細胞淋巴瘤患者體內的擴增和持續性。目前已有CD28、CD137、CD134、ICOS 和DAP10等多種共刺激
分子的胞內區用于二代CAＲ的研究[1]。
圖A T細胞受體的結構：由異源二聚體形式的抗原特異性α和β鏈組成，α和β鏈與CD3復合體的ε?δ?γ和ζ鏈緊密相連。T細胞受體與HLA結合。
圖B CAR：包括與腫瘤抗原結合的單鏈可變片段（scFv）和細胞內的共刺激結構域，如CD28和4-1BB以及CD3ζ鏈，它們驅動信號激活和CAR T細胞擴增。
（圖源：Longo D L , June C H , Michel S . Chimeric Antigen Receptor Therapy[J]. New England Journal of Medicine, 2018, 379(1):64-73.）
2、載體系統的選擇
CAR的載體系統可以使用質粒、γ-逆轉錄病毒或慢病毒等。應用于制備CAR-T細胞的質粒或病毒都必須經過鑒別試驗、復制型病毒檢測、無菌試驗、內毒素檢測、支原體檢測、相關添加成分的殘留量檢測、病毒滴度測定以及效力試驗[2]。
不同載體系統的比較[3]：
| 載體系統 | 特點 | 優勢 | 劣勢 |
| 逆轉錄病毒 | 穩定整合 | 具有20多年的臨床安全性研究史 | 致造血干細胞插入突變 某學淋巴細胞（如NK）修飾效率較低 攜帶的DNA///片段大小小于慢病毒 易于轉基因沉默，尤其在造血干細胞中 需要誘導細胞分裂以利于整合 |
| 慢病毒 | 穩定整合 | 轉染效率高，可轉染靜息T細胞，插入誘變風險較逆轉錄病毒低 | 生產成本高于逆轉錄病毒 LTR序列和HIV附屬基因存在遺傳毒性（三代自我失活載體已取出來這些序列，安全性有提升） |
| DNA轉座子 | 穩定整合 | 攜帶DNA能力強，轉基因表達水平高且持久，制備成本低 | 臨床安全性和有效性方面尚在研究 需要轉座酶和轉座子兩種GMP試劑 |
| DNA質粒 | 穩定整合 | 制備成本低廉 隨機插入風險 | 穩定整合需要體外長期篩選 |
| mRNA電穿孔 | 瞬時表達 | 無插入風險，安全性高 | CAR表達時間短 需要輸入多個劑量CAR-T細胞 |
五、CAＲ-T療法的優勢和局限性
1、CAＲ-T療法的優勢
1）無MHC限制性
2）可識別的抗原種類多
3）可以在體內繼續增殖
2、CAR-T療法的局限性
1）毒副作用
2）血液腫瘤可能復發，實體瘤治療效果差
3）制備費用高，難以產業化
六、CAR-T療法未來的研究方向
基于CAR-T治療暴露出的局限性，目前有關CAR-T的研究和開發，主要圍繞自///殺開關，消除標記，藥理抑制和雙分子CAR設計四個方向來進行，旨在降低CAR-T細胞毒性和提高CAR-T治療的有效性[4]。
（圖源：Schmidts A , Wehrli M , Maus M V . Toward Better Understanding and Management of CAR-T Cell–Associated Toxicity[J]. Annual Review of Medicine, 2021, 72(1).）
參考文獻：
[1]Longo D L , June C H , Michel S . Chimeric Antigen Receptor Therapy[J]. New England Journal of Medicine, 2018, 379(1):64-73.
[2]中國醫藥生物技術協會《嵌合抗原受體修飾 T 細胞（CAR-T細胞）制劑制備質量管理規范》
[3]唐曉義, 陳虎, 張斌. 嵌合抗原受體修飾T細胞免疫治療的機遇與挑戰[J]. 解///放///軍醫藥雜志, 2015, 000(001):12-25.
[4]Schmidts A , Wehrli M , Maus M V . Toward Better Understanding and Management of CAR-T Cell–Associated Toxicity[J]. Annual Review of Medicine, 2021, 72(1).
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| 相關操作 | 產品名稱 | 產品貨號 | 產品規格 |
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| Fetal Bovine Serum Origin South America Gold 胎牛血清（南美特級） | 40130ES76 | 500mL | |
| 慢病毒構建與包裝 | Lentiviral Packaging Kit 慢病毒包裝試劑盒 | 41102ES10/20/40 | 10T/20T/40T |
| Hieff Trans™ Liposomal Transfection Reagent 脂質體核酸轉染試劑 | 40802ES02/03/08 | 0.5mL/1mL/5*1mL | |
| 內毒素檢測與去除 | 動態濁度法內毒素檢測鱟試劑 | 60401ES06 | 1.7mL |
| Endotoxin Removal Kit 內毒素去除試劑盒 | 60404ES03 | 1Kit | |
| 支原體檢測與清除 | MycAwayTM Plus-Color One-Step Mycoplasma Detection Kit 一步法快速支原體檢測試劑盒 | 40612ES25/60 | 25T/100T |
| DNA殘留去除 | UCF.ME Nuclease Ultrapure（Endotoxin-free）全能核酸酶 | 20125ES25/50/60 | 25KU/50KU/100KU |
| 活體成像 | D-Luciferin, Sodium Salt D-熒光素鈉鹽 | 40901ES01/02/03/08/10 | 100mg/500mg/1g/5g/10g |
