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qPCR常見問題及解決方案（建議收藏，文末有彩蛋哦~）
在RT-qPCR的實驗過程中，大家或多或少都會遇到擴增曲線異常、溶解曲線異常、重復性差等問題。小翊給大家整理了SYBR Green染料法的常見問題及解決方案，以供大家參考。
Part 1 擴增曲線異常
正常的擴增曲線一般呈S型，Ct值///好在20-30之間。異常的擴增曲線包括Ct值偏大、無平臺期、平臺期下降等問題。
1.Ct值偏大（如Ct值＞30）
1）模板量低或基因表達豐度低，建議增加模板量觀察Ct值能否成相應倍數減少。
2）qPCR整個反應條件不適宜或引物設計不當導致擴增效率低，建議通過標準曲線確認擴增效率。
3）擴增產物過長，建議用三步法程序擴增或優化引物，擴增產物長度///好不超過300bp。
4）體系中可能存在抑制劑影響酶的活性，建議梯度稀釋模板或重新制備純度更高的模板。
2.擴增曲線無法達到平臺期
基因豐度低、循環數較少，建議增加循環數或選擇適合低豐度基因定量的產品。
3. 擴增曲線平臺期下降
可能是基線范圍設置不當，這種一般是由于模板量過高導致的。建議減小基線的終點值（一般建議設置為Ct值-4），調整后見下圖。
4.擴增曲線平臺期鋸齒狀
1）RNA純度低，建議梯度加大模板稀釋倍數看優化效果或重新制備高純度RNA重新實驗。
2）儀器長時間未校準，建議定期進行儀器校準保養。
5.擴增曲線雜亂無規律
可能是ROX濃度和機型不匹配，建議調整ROX濃度，調整后見下圖。
【注】可以在儀器上將參比染料設置由ROX更改為NONE，取消ROX的校正功能，查看擴增曲線是否恢復正常，即可判定是否是ROX導致的。
6.有熔解曲線，無擴增曲線
可能是擴增程序設置錯誤，未進行熒光信號搜集，建議重新實驗，增加擴增程序中延伸階段熒光信號的搜集。
7.擴增曲線有向上或向下的尖峰
可能是儀器故障，建議維修儀器。
8. 陰性對照有擴增
1）NTC有擴增，可能有以下兩種情況：
①Ct＞35，熔解曲線Tm值＜80℃（一般正常qPCR產物，大小在100-300bp之間，熔解曲線Tm大多在80℃以上），可能是引物二聚體導致，可進一步優化引物。
②有Ct值且＜35，表示反應體系被污染，可逐步排除污染源。
2）NRC有擴增
NTC正常，NRC有Ct值，可能是RNA含有gDNA污染。建議用DNase I消化或使用含有gDNA去除的反轉錄試劑盒（如Cat 11141ES）。
【注】NTC是指將H2O代替模板的陰性對照反應；NRC是指將未反轉錄的RNA作為模板的陰性對照反應。
9.復孔重復性差
1）加樣誤差導致，建議移液器定期校準，另外可通過擴大反應體系或提前配制好預混液優化。
2）模板量低，建議提高模板量，使Ct值落在15-30之間。
3）儀器長時間未校準，建議定期進行儀器校準保養。
Part2 熔解曲線異常
熔解曲線常用來判斷qPCR結果的特異性，理想的熔解曲線為單峰，異常的熔解曲線可能會出現雙峰、雜亂等情況，下面我們來逐一分析。
1.熔解曲線出現雙峰
1）雙峰，雜峰Tm在80℃之前
①可能存在引物二聚體，建議降低引物濃度或重新設計引物等方式優化。
②可能是模板量過低，促使了引物二聚體的形成，建議提高模板量。
2）雙峰，雜峰Tm在80℃之后
①引物特異性過差導致非特異性產物擴增，建議Blast檢查引物特異性或重新設計引物。
②gDNA污染，可通過NRC進行確認。若NRC有Ct值，可重新制備模板。
2. 熔解曲線單峰但不尖銳
可能存在大小相近的非特異性產物，建議進行高分辨率瓊脂糖電泳確認。
3.熔解曲線單峰但Tm值在80℃以前
推測未加模板，僅有引物二聚體的擴增。進行高分辨率瓊脂糖電泳確認產物或重復實驗。
4.熔解曲線峰型雜亂
1）反應體系污染，結合NTC和NRC結果確認污染情況，建議從水，引物，酶和環境等逐一排除污染。
2）試劑暴露在強光或高溫下導致試劑失效，建議用新的試劑做對比實驗。
3）儀器長時間未校準，建議定期進行儀器校準保養。
4）耗材與儀器不匹配，需確認對應儀器對耗材的要求。
5.有擴增曲線，無熔解曲線
可能是熔解程序設置錯誤，未搜集熒光信號，建議重新實驗，增加熔解曲線階段的信號搜集。
6.兩種試劑平行對比，同一產物Tm值不同
可能是不同試劑的促解鏈成分或含量不一樣，導致同一產物解鏈溫度Tm值不一樣。
7.溶解曲線前端起雜峰
可能是ROX濃度與機型不匹配，建議取消ROX校正查看溶曲是否正常，調整后如下圖。
【注】可以在儀器上將參比染料設置由ROX更改為NONE，取消ROX的校正功能，查看溶解曲線是否恢復正常，即可判定是否是ROX導致的。
以上就是小翊為大家整理的RT-qPCR實驗中可能遇到的問題及相應的建議，如果您還有其它問題，歡迎留言咨詢~
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