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干貨分享|酶切法DNA建庫“十問實答”，助您建庫無憂
第二代測序(NGS)技術迅猛發展，越來越多的科研工作者采用NGS技術作為課題研究的主要手段。NGS過程中，基因文庫的質量直接影響后續的測序工作，因此構建基因文庫是整個測序過程中///為關鍵的步驟。其中酶切法DNA文庫構建，越來越多的獲得廣大科研人員的青睞。相信在運用酶切法構建DNA文庫的過程中，大家或多或少的會遇到各種問題。
他山之石，可以攻玉！接下來小翊帶領大家一起解決實驗開展前后的可能遇到的各種困惑。
實驗開展前，“千頭萬緒”
1、DNA文庫構建方法的選擇：為什么酶切法建庫如此備受青睞？
酶切法構建DNA文庫，相較于傳統的超聲法和轉座酶法具有以下優勢：
- 無偏好片段化酶：具有穩定的片段化效果，無需復雜的機械片段化過程。酶切產物片段大小同樣本類型、Input DNA量和GC含量等均無相關性，僅與酶切時間有關。
- 建庫流程精簡：一步完成片段化/末端修復/加A ，片段化/末端修復/加A （30min）-接頭連接（15min）-純化/分選（30min）-文庫擴增（15min）-純化分選（30min），常規建庫預計耗時約2h，PCR-free建庫預計耗時1h。
- 寬泛的樣本投入范圍：相比較固定投入量，固定酶切時間的TN5建庫，酶切法建庫適用500 pg-1 μg，滿足個性化建庫。
圖1.翊圣Onepot系列酶切法建庫優勢
2. 酶切法建庫運用的是什么酶，類似限制性酶切酶嗎，具體如何打斷DNA呢？
不同于限制性酶切酶，片段化酶是隨機內切酶，不受特定酶切位點的限制，隨機切割對應模板DNA，片段化的產物屬于粘性末端，后續需要進行末端修復。
舉例：投入500 pg-1000 ng的正常人類基因組DNA，30 ℃ 15min, 可將DNA酶切為150-550 bp左右的長度。
3. 酶切法建庫適合哪些應用研究嗎，對樣本具有普適性嗎？
片段化酶酶切法建庫可適用全基因組測序（含PCR-free文庫構建）、全外顯子測序、靶向捕獲測序、宏基因組測序等。適合樣本類型是gDNA、cDNA和高質量的FFPE樣本等，不適合cfDNA（cfDNA無需打斷）。
4、酶切法建庫試劑盒針對哪些樣本建庫效果比較好？
兼容范圍為500 pg – 1μg Input DNA。應盡可能使用A260/A280= 1.8-2.0的高質量Input DNA。基因組DNA和cDNA均可獲得高產高質的文庫。
舉例：
展示為翊圣onepot II系列12204應用于cDNA文庫構建（ds-cDNA）
背景：客戶得到逆轉錄的ds-cDNA，全長1.1kb左右，想酶切至300 bp左右。
結論：Input DNA 50 ng左右，酶切4-10 min，PCR 8Cycles，產量>3μg,若需要更集中的文庫，可進行雙輪分選。
5、對于不同類型的DNA樣本，酶切時間如何控制？
對于常規的高質量基因組DNA，酶切時間如下：
當然了，為保證優質精確的片段化效果，建議在自己的實驗體系中進行微調。
實驗開展后，“五味陳雜”
6、gDNA///片段化參考說明書酶切條件酶切20 min，竟然切不動？
一般優先考慮DNA的質量問題，比如 Input DNA中引入高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽離子，可能會影響酶切效果，建議將DNA稀釋在ddH2O或不含EDTA的10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中再進行片段化。其次，如果樣本是反轉錄得到的全長cDNA，則需考慮樣本純度問題。另外，對于環狀DNA的酶切，需要另行摸索酶切時間體系。特殊樣本可考慮磁珠純化之后進行酶切或適當延長酶切時間。
備注：紅色曲線表示，30度酶切20 min未切開
7、FFPE樣本，酶切時間太難控制了？
*，FFPE樣本雖然使組織得以長期保存，但其特殊的制作方法和保存過程對核酸分子造成多方面的影響：核酸與蛋白交聯、降解嚴重等諸多問題。我們先來看下不同質量的FFPE樣本，采用相同的酶切條件影響有多大。
舉例：相同酶切條件下，質量高的樣本酶切效果較好，滿足需求（樣本4），質量差的樣本出現過度酶切現象，酶切片段偏小（樣本1/3）
因此對于不同降解程度的FFPE樣本，建議做好質量控制，對樣本進行分層級，不同層級的推薦酶切時間參考下表。對FFPE樣本，建議搭配翊圣FFPE修復試劑FFPE DNA Repair Reagent(Cat#12606).
備注：FFPE樣本DNA質量也可通過瓊脂糖凝膠電泳膠圖簡單判斷，高質量樣本-DNA質量大于10kb，條帶明亮單一，建議酶切10 min左右；一般質量樣本-膠圖顯示無明顯主帶，整體彌散條帶，建議酶切6-8 min；質量較差樣本-膠圖無主帶，整體條帶弱，建議酶切2 min；極差FFPE樣本，建議可不酶切，搭配FFPE修復試劑直接建庫。
8、DNA酶切后出現大片段殘留？
酶切產物出現大片段殘留現象，考慮Input DNA純度外（參考FAQ 6），建議適當延長酶切時間。
9、酶切時間也不長，竟然過度酶切了?
以插入片段300 bp為例，白細胞gDNA，30 度酶切10min，出現如下圖過度酶切現象。建議參考酶切條件需要考慮不同樣本gDNA大小，如白細胞gDNA較小，應適當縮短酶切時間，否則易出現如下過度酶切現象。
10、酶切法建庫，如何做到較好的質量控制？
1）文庫濃度檢測，qubit法或qPCR ；
2）文庫長度檢測，瓊脂糖凝膠電泳測定；
3）文庫質量鑒定，Agilent 2100/2200；
4）文庫大小分布、引物二聚體和過擴增產物的缺失，應通過電泳方法進行確認.
構建優異的DNA文庫，除了明確以上因素之外，還需要選擇高質量的建庫產品。翊圣生物為滿足廣大科研工作者的NGS建庫實驗需求，推出了NGS建庫整體解決方案，方便大家根據實驗需求進行選擇。
試劑類別 | 產品名稱 | 貨號 | 規格 | 目錄價/元 | */元 |
建庫試劑盒 Illumina平臺
| Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina® 一步法DNA建庫試劑盒 | 12203ES08/24/96 | 8/24/96 T | 3656/7486/28567 | 2194/4492//17140 |
Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit for Illumina® 一步法DNA建庫試劑盒 | 12204ES08/24/96 | 8/24/96 T | 3683/7583/28663 | 2210/4550/17198 | |
建庫試劑盒 華大MGI平臺
| Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI | 13331ES16/96 | 16/96 T | 5363/26563 | 3486/17266 |
磁珠 | Hieff NGS® DNA Selection Beads 分選磁珠(完美替代AMPure XP Beads) | 12601ES03/08/56/75 | 1/5/60/450 ml | 296/986/6286/26186 | 192/641/4086/17021 |
接頭 | Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina® Set1/2/3/4 | 12615/6/7/ 12618ES04/16 | 12×4 T/12×16 T | 1256/4536 | 816/2948 |
定量 | dsDNA HS Assay Kit for Qubit® | 12640ES60/76 | 100/500T | 686/2696 | 446/1752 |
1×dsDNA HS Assay Kit for Qubit® | 12642ES60/76 | 100/500T | 853/2983 | 554/1939 |
