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基因治療領域的*--mRNA疫苗
據路透社3月15日報道：美國政府正試圖說服疫苗研發的德國公司CureVac搬遷到美國并壟斷其疫苗生產，而德國政府希望該公司能留在本國。那么，CureVac公司擁有什么重要的東西竟讓兩個國家政府直接出面進行爭奪？答案就是——mRNA疫苗制備技術。
什么是mRNA疫苗
mRNA疫苗是將RNA在體外進行相關的修飾后傳遞至機體細胞內表達并產生蛋白抗原，從而導機體產生針對該抗原的免疫應答，進而擴大機體的免疫能力[1,3]。
圖1：直接注射mRNA疫苗效果示意圖[2]
mRNA疫苗的分類
mRNA疫苗分為非復制性mRNA(nonreplicating mRNA)和自擴增mRNA(self-amplifying mRNA)兩類：自擴增mRNA不僅編碼目標抗原，而且還編碼能夠使細胞內RNA擴增和蛋白表達的復制機制。非復制性mRNA疫苗僅編碼目標抗原并包含5′和3′非翻譯區（UTR），它們提供對適應性和先天免疫力的綜合刺激，即原位抗原表達和危險信號傳遞，具備有以下應用特性[2,3]
●可提供對適應性和先天免疫力的綜合刺激，即原位抗原表達和危險信號傳遞
●可以誘導“平衡”免疫反應，包括體液和細胞效應因子以及免疫記憶
●可結合不同的抗原而不會增加疫苗配制的復雜性
●可通過重復性的疫苗接種實現持續的免疫潛力提升，并且對載體沒有或有很少的免疫反應
●熱穩定mRNA疫苗可簡化疫苗的運輸和儲存
圖2：mRNA疫苗的示意圖及其抗原表達的機制[4]
mRNA疫苗的特點
相比傳統疫苗，mRNA疫苗生產工藝簡單、開發速度快、無需細胞培養、成本低。相較與DNA疫苗，mRNA疫苗無需進入細胞核，沒有整合至宿主基因組的風險，半衰期可以通過修飾進行調整。
表1：mRNA疫苗的優缺點
| 優點 | 不足 |
mRNA疫苗 | 研發快速，疫苗生產僅需40天 | mRNA在生理條件下的不穩定性，易降解 |
無需任何的核定位信號、轉錄 | 引發不必要的免疫反應 | |
不會整合到基因組，避免可能的治療性突變 | 安全性和有效性有待驗證 |
圖3：mRNA疫苗生產制備流程圖[4]
mRNA疫苗制備的改進策略
由于mRNA自身的穩定性差、易被組織內的核酸酶降解、進入細胞的效率較低、翻譯效率較低等問題，這些缺陷限制了mRNA疫苗的應用，不同的遞送載體對mRNA疫苗的穩定性和翻譯效率也起到非常關鍵的作用，遞送載體可分為病毒載體和非病毒載體（包括脂質體、非脂質體、病毒、納米顆粒等）。因此需要進行相關的改進措施，以下是mRNA制備的藥理學改進策略[2]。
1、合成帽類似物或使用加帽酶通過與真核翻譯起始因子4E（EIF4E）結合來穩定mRNA并增加蛋白翻譯
2、調節5′-非翻譯區（UTR）和3′-UTR中的元件來穩定mRNA并增加蛋白翻譯
3、添加Poly（A）尾可使mRNA穩定并增加蛋白質翻譯
4、修飾核苷來減少先天免疫激活并增加翻譯
5、使用RNase III處理和快速蛋白質液相色譜（FPLC）純化可降低免疫激活并增加翻譯
6、優化序列或密碼子來增加翻譯
7、翻譯起始因子和其他方法的共同遞送來改變翻譯和免疫原性
圖4：體外轉錄（IVT）mRNA生產和裝配過程[5]
相關公司及疫苗簡介
目前，已有多家企業以mRNA為研究基礎或擁有mRNA研發平臺，部分產品也已進入臨床研究階段，相關信息如下表2、3所示。
表2：主要的mRNA疫苗公司概況
公司名稱 | 成立時期 | 注冊地 | 研究技術平臺 |
Argos Therapeutics | 1997 | 美國 | 擁有*免疫療法技術Arcelis平臺 |
CureVac | 2000 | 德國 | 擁有RNActive、RNArt、RNAntibody、RNAdjuvant 技術平臺 |
BioNTech | 2008 | 德國 | 擁有mRNA藥物/疫苗、細胞治療、抗體藥物等藥物研發平臺 |
Moderna | 2010 | 美國 | 擁有mRNA技術、交付技術和制造流程mRNA轉化藥物平臺 |
eTheRNA Immunotherapies | 2013 | 比利時 | 擁有基于APC激活mRNA平臺開發新的免疫腫瘤療法 |
斯微生物 | 2016 | 中國 | 擁有中國的mRNA藥物平臺和產品管線 |
注：以上信息均來自對應公司信息
表3：相關mRNA疫苗及藥物臨床進展概況
公司名 | 藥物編號 | 適應癥 | 臨床進展 |
BioNTech |
BNT1222 | Melanoma（黑色素瘤） | Phase 2 |
BNT112 | Prostate cancer（前列腺癌） | Phase 1 | |
BNT115 | Ovarian cancer（卵巢癌） | Phase 1 | |
BNT113 | HPV16+ head and neckcancer1（HPV和頭頸癌） | Phase 1 | |
BNT162 | C/O/V/I/D-19 | Pre-clinical | |
CureVac | CV8102 | Melanoma、Adenoidcystic Carcinoma（黑色素瘤等腫瘤微環境調節） | Phase 1 |
CV9202 | NSCLC（非小細胞肺癌） | Phase 1 | |
CV7202 | rabies virus（狂犬病病毒） | Phase 1 | |
CV7301 | Influenza (流感) | Pre-clinical | |
Moderna | mRNA-4157 | Solid tumors(實體瘤) | Phase 1 |
mRNA-4157 | Melanoma（黑色素瘤） | Phase 2 | |
mRNA-1647 | Cytomegalovirus (CMV，巨噬細胞病毒) | Phase 1 | |
mRNA-1893 | Zika（寨卡病毒） | Phase 1 | |
mRNA-1273 | C/O/V/I/D-19 | Phase 1 |
注：以上數據信息均來自對應BioNTech 、CureVac 、Moderna公司公開信息（截止日期：20200330）
制備所需關鍵原料
mRNA疫苗的制備需要多種原料來保證疫苗的成功開發，翊圣生物作為國內分子酶產業創新ling導者，通過*分子酶雙向技術平臺、大規模蛋白發酵純化技術平臺，目前已成功開發各類分子酶相關原料的產品，并獲得了廣大用戶的認可。
表4：相關mRNA疫苗所需原料
應用 | 產品名稱 | 貨號 | 規格 |
mRNA疫苗制備原料 | Vaccinia Capping Enzyme牛痘病毒加帽酶 | 10615ES76/84 | 500/2000 U |
T7 RNA Polymerase （50 U/μl） | 10618ES90/96 | 5000/25000U | |
GTP (100 mM) 鳥苷三磷酸溶液（100 mM） | 10132ES03 | 1 mL | |
RNase A (100 mg/mL) 核糖核酸酶A（100 mg/mL） | 10406ES03 | 1 mL |
應用展望
mRNA疫苗以其生產工藝簡單、開發速度快、成本低等正越來越受到各方的關注，將在腫瘤、傳染病及感染性疾病等預防和治療領域有著廣闊的應用前景。
【1】苗鶴凡, 郭勇, 江新香. mRNA疫苗研究進展及挑戰[J]. 免疫學雜志, 2016(05):446-449.
【2】Pardi N , Hogan M J , Porter F W , et al. mRNA vaccines — a new era in vaccinology[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2018.
【3】Kramps T., Elbers K. (2017) Introduction to RNA Vaccines. In: Kramps T., Elbers K. (eds) RNA Vaccines. Methods in Molecular Biology, vol 1499. Humana Press, New York, NY
【4】Maruggi G , Zhang C , Li J , et al. mRNA as a Transformative Technology for Vaccine Development to Control Infectious Diseases[J]. Molecular Therapy, 2019.
【5】Sergio Linares-Fernández, Céline Lacroix, ,Tailoring mRNA Vaccine to Balance Innate/Adaptive Immune Response,Trends in Molecular Medicine,Volume 26, Issue 3,2020,Pages 311-323,
關于翊圣生物
上海翊圣生物科技有限公司（Yeasen Biotech Co., Ltd）成立于2009年，是國家高新技術型企業，長期專注于分子酶原料及建庫試劑盒等產品的研發和生產。
我們的目標讓下游企業節省更多的成本，為中國精準醫療的發展貢獻自己的力量。
翊圣生物擁有*分子酶雙向技術平臺、大規模蛋白發酵純化技術平臺、高效抗體篩選技術平臺，目前已成功開發各類診斷分子酶、二代測序建庫酶等40余種，并實現工業放大。翊圣生物開發的PCR類、NGS類、體外診斷（IVD）和相關酶原料等產品獲得了廣大客戶的認可。此外，我們還為工業客戶提供定制化開發服務，以滿足個性化需求
