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測序數據不好？是不是建庫出了問題？！
——從測序數據看文庫構建
高通量測序中的文庫構建指的是在DNA兩端連接特定的接頭從而使其符合測序平臺要求的過程，在高通量測序過程中，文庫質量直接影響終測序數據的質量，打個比方，如果文庫上機測序的濃度很低，樣本在FlowCell上擴增所形成的DNA樣本簇就會很少，測序數據量也將減少，這就可能導致測序失敗，所以我們說文庫的質量控制和質量評估也是NGS中的關鍵步驟。
文庫如何質控？
評估文庫質量的方法有哪些？
文庫質控：文庫在上機之前都有會進行質量檢測，質量檢測合格的文庫才會上機測序。文庫上機之前的文庫質控主要包括文庫片段大小和文庫濃度的質控，具體質控標準和實驗設計見往期推送：文庫質檢方案的合理設計--文庫分布、文庫濃度、文庫質
文庫評估：文庫評估方法除了文庫大小和濃度之外，還包括文庫轉化率、文庫復雜度、均一性、準確性和覆蓋度等。
1）文庫轉化率：是評估文庫質量的重要指標，它指的是文庫中兩端都連上接頭的目的片段占總片段數的比值，也代表測得產量與理論高產量之間的比值，這里的理論高產量考慮了PCR的擴增效率問題及純化產生的損失。計算方法如下：
理論高產量=輸入量×（1+PCR擴增效率）（PCR循環數）×（純化回收率）（clean up數）
為什么說文庫轉化率是重要指標呢？這是因為只有雙端都連接上接頭的目的片段才能在FlowCell上面通過橋式擴增形成簇，終完成測序過程，而不是雙端都連上接頭的目的片段終都不能完成測序過程，視為無效片段，如果這樣的片段過多直接影響終輸出數據的過少，甚至可能直接導致測序的失敗。
圖1.雙端帶接頭的DNA段在Flowcell上擴增圖
2）文庫復雜度：指的是文庫中DNA序列的復雜程度，一定的文庫復雜度對后期測序數據的分析尤為重要，復雜度高的文庫測序得到的數據重復讀數少，可以帶來更多有意義的信息，反之，低復雜度的文庫在信號讀取時往往產生簇信號混雜，易產生低質量的測序數據。
文庫復雜度與Input樣本質量、文庫的轉化率、文庫擴增時循環數有關。當文庫的轉化率越高時，能從樣品種捕獲更多的特異分子，文庫復雜度就越高；當輸入樣本量越低或文庫擴增循環數越多時，文庫中不能帶來有意義信息的重復讀數就會增多，則文庫的復雜度越低。
表1.測序數據關鍵參數比較
Sample Input | Library Prep | Uniquely Mapped | Duplication Rate | Transcripts Detected | Genes Detected |
4 μg | A* | 69% | 31% | 111.370 | 20.547 |
B* | 76% | 24% | 112.136 | 21.016 | |
500 μg | A* | 64% | 36% | 109.810 | 20.134 |
B* | 71% | 29% | 110.690 | 20.644 |
3）均一性：指的是讀取數據在基因組或目標區域的分布均一程度。其生信分析圖如圖2所示，一般認為覆蓋越均勻，達到特定深度所需的測序數據就越少，覆蓋均一性的偏向通常是在文庫制備和文庫擴增步驟中引入的，也就是說，覆蓋均一性很多時候取決于GC含量。
圖2.測序數據均一性
4）準確性：
NGS文庫制備的準確性越高，你對變異報告的信任程度就越高。核苷酸錯誤通常在PCR擴增以及測序過程中引入。測序錯誤通常低于1%。通過使用高保真PCR試劑，可盡量減少文庫擴增的錯誤。NGS對照樣品也有助于評估NGS流程的準確性。
圖3.PCR擴增存在一定的錯配率
5）測序深度和覆蓋度：
假設對長1000 bp的目標區域進行捕獲測序，每個read長10 bp，總共得到3000個reads，把所有的reads對比到目標區域后，1000 bp的目標區域中有990 bp的位置至少有1個read覆蓋到，換言之剩余的10bp沒有1個read覆蓋。
則此時：
測序深度（depth）3000*10/1000=30 也就是說測序深度為30*
覆蓋度（coverage）990/1000*100%=99% 這次測序覆蓋度為99%
同理：
假設對長100bp的目標區域進行捕獲測序，每個read長5bp，總共得到200個reads，把所有的reads對比到目標區域后，100bp的目標區域中有98bp的位置至少有1個read覆蓋到，換言之剩余的2bp沒有1個read覆蓋。
深度（depth）200*5/1000=10 也就是說測序深度為 10*
覆蓋度（coverage）98/100*100%=98% 這次測序覆蓋度為98%
文庫構建中的哪些步驟會直接影響測序質量？
NGS的終目的就是得到測序數據助力于下游科學研究或實際應用，其中文庫構建是測序數據的重要影響因素，文庫構建一般包括以下幾類步驟（以DNA為例）：樣本片段化、接頭連接、分選/純化、文庫擴增。文庫對測序數據的影響，具體到文庫構建的每個步驟，參考表2。
表2.建庫步驟對測序結果的影響
步驟 | 評估指標 | 對測序結果的影響 |
樣本片段化 | 打斷隨機性 | 文庫質量；測序數據的均一性和覆蓋度 |
片段大小是否集中 | 文庫濃度；測序數據覆蓋度 | |
接頭連接 | 接頭連接效率 | 文庫轉化率；文庫復雜度；均一性；準確性和覆蓋度 |
分選/純化 | 片段大小的一致性 | 片段大小與測序儀大小不匹配將無法上機測序 |
回收效率 | 文庫濃度；測序數據覆蓋度 | |
文庫擴增 | 擴增偏好性 | 文庫復雜度；均一性 |
擴增效率 | 文庫濃度；文庫復雜度 |
HB190313
