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PCR方法操作簡便,靈敏度高,可檢測出少至0.1pg的目的DNA。目前已廣泛應用于多種病原微生物的檢測。
乙肝病毒(HBV)感染引起的乙型肝炎,在我國發病率很高,而且HBV與肝硬化、原發性肝癌關系密切,因此,HBV的診斷極為重要。PCR檢測HBV-DNA敏感性明顯高于傳統的血清學方法,且能顯示HBV在體內復制情況,直接反映患者血液的感染性,并對模棱兩可的或與臨床表現不符的血清學結果,PCR技術有助于明確診斷。
【材料】
待檢血清、HBV-PCR反應液 20管(20μl/ 管)、HBV-DNA裂解液、陽性模板、溴化乙錠、PCR擴增儀、電泳儀、紫外線分析儀。
【方法】
1、標本處理:
取混勻的血清20μl加20μl裂解液,攪勻后100℃沸水浴10分鐘,zui后15000rpm/分鐘離心3分鐘,取4μl上清待檢。
2、加樣及PCR:
取反應液一管(使用前稍加離心),加4μl待檢上清或陽性對照于底層反應液中,混勻后高速離心片刻,然后置94℃預變性2分鐘,再按94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/60秒擴增35個循環。
3、電泳與結果判斷:
取15μl 反應液,經2%瓊脂糖凝膠電泳(5V/cm)30分鐘后,在紫外燈下觀察結果,若410bp處出現橙黃色帶,則HBV為陽性。
【注意事項】
1、反應管中加好所有試劑后,應立即上機擴增,以免形成過多的二聚體。