實驗程序

RNA

酶的抑制劑
破碎細胞和滅活RNA酶同步進行的方法
 

如不謹慎操作，外源性RNA酶可以通過下述途徑污染RNA制品：

（１）玻璃制品、塑料制品和電泳槽 滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA酶，可以不經預處理直接用于制備和貯存RNA。實驗室用的普通玻璃器皿和塑料制品經常有RNA酶法染，使用前必須于180 ℃干烤８小時或更長時間（玻璃器皿）或用氯仿沖洗（塑料制品）。另一種方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯，試管和其他用品。DEPC是RNA酶的強烈抑制劑，但其作用并不是的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌滿DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小時，然后用滅菌水淋洗數次， 并于100℃干烤15分鐘（Kumar和Lindberg,1972）。在15 lbf/in2（1.034x105Pa）高壓蒸氯滅菌15分鐘。上述處理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進行修飾。
 

羧甲基化的RNA在無細胞體系中翻譯效率很低，然而，除非其中大部分嘌呤堿基均被修飾，否則其形成DNA：RNA或RNA：RNA雜交休的能力并不明顯降低。用于RNA電泳的電泳槽應用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿3％的H2O2溶液，于室溫放置10分鐘，然后用0.1 ％DEPC處理過的水*沖洗電泳槽。能留出一些玻璃器皿、塑料制品和電泳槽作上特殊標記，存放在地點，為RNA實驗。
 

（２）研究人員造成的污染 RNA酶zui主要的潛在污染源是研究人員的手。因此，在準備分離的和分析RNA的材料和溶液時，主有涉及RNA的一切操作過程中，都應戴一次性手套，接觸“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此進行RNA實驗時應勤換手套。
 

（３）污染的溶液 用高壓滅菌的水和RNA研究的化學試劑配制溶液，用干烤過的藥匙稱取試劑，將溶液裝入無RNA酶的玻璃器皿。可能的話溶液均應用0.1％DEPC于37℃至少處理12小時，然后于100℃加熱15分鐘或在15lbf/in2（1.034x105Pa）的高壓下蒸氣滅菌15分鐘。注：DEPC可與胺類迅速發生化學反應，因些不能用來處理含有Tris 一類的緩沖液。可存幾瓶新的未開封的Tris晶體以制備無RNA酶的溶液。
 

下面介紹３種廣泛應用的特異性RNA酶抑制劑。

（１）RNA酶的蛋白質抑制劑是 從人胎盤分離的一種蛋白質可與多種RNA酶緊密結合（KI≈3x1010）形成非共價結合的等摩爾復合物，使RNA酶失活。此蛋白質體內可能是血管生成素的抑制劑，血管生成素是氨基酸序列和推測的三級結構與胰RNA酶類似的一種血管生成因子， 幾個廠家以不同的商品名出售這種抑制劑，該蛋白質應置于含5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的50％甘油中，貯存于－20℃。抑制劑制品凍融數次后或放置在氧化條件下即應棄之不用，因為上述處理會使蛋白質變性從而釋放出所結合的RNA酶。因此，在使用變性劑裂解哺乳動物細胞這一提取RNA的初始步聚中不應使用這種蛋白抑制劑。然而職用更溫和的裂解方法時應使用這種抑制劑，并且在后續的所有RNA純化步驟中均應有此蛋白質存在。由于酚抽提可以除蛋白質抑制劑，故應在純化過程中補加幾次抑制劑。其zui大活性的發揮要求巰基試劑，而且它并不干擾反轉錄或mRNA在無細胞體系中的翻譯。
 

（２）氧釩核糖核苷復合物 這種由氧釩（1V）離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復合物，是量種過渡態類似物，它能與多種RNA酶結合并幾科能地抑制RNA酶的活性。這４種氧釩核糖核苷復合物可加入完整細胞中，在RNA提取和純化的所有過程中，其使用濃度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母細胞中進行翻譯， 并能作為某些外酶促反應（如mRNA反轉錄）的模板。然而氧釩核糖核苷復合物強烈抑制mRNA在無細胞體系中的翻譯，因此必須用含0.1 ％羥基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl（pH7.8）平衡]多次抽提以去除之。有幾家公司出售氧釩核糖核苷復合物。
 

（３）Macaloid（硅藻上）Macaloid是一咱粘土，很多年前就發現它能吸附RNA酶，用緩沖液將其制成漿液，以0.015％（W/V）的終濃度溶解細胞。 這種粘土隨同它所吸附的RNA酶可在后續的RNA純化過程中（如酚抽提后）經離心去除。
 

用強烈變性如鹽酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白質， 導致細胞結構破碎，核蛋白由于其二級結構的破壞而從核酸上解離下來。RNA酶可耐受多種處理等，因此可聯用上述試劑，從組織中，如富含RNA酶的胰腺中，提取完整無損的RNA。下述實驗程序系列利用RNA酶抑制劑和（或）能迅速滅活RNA酶的有關方法從組織或細胞培養物中分離總RNA、核內RNA和胞質內RNA。