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詳情請(qǐng)看：細(xì)胞增殖檢測(cè)：3H-TdR滲入法實(shí)例
一、原理
T細(xì)胞、B細(xì)胞表面具有識(shí)別抗原的受體和有絲分裂原受體，在特異性抗原刺激下可使相應(yīng)淋巴細(xì)胞克隆發(fā)生增殖。植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA），抗CD2、抗CD3McAb作為多克隆刺激劑可選擇性地刺激T細(xì)胞增殖；而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌體（SAC）、脂多糖（LPS，對(duì)小鼠有作用）則刺激B細(xì)胞發(fā)生增殖；美洲商陸（PWM）、腫瘤刺激劑PMA對(duì)T、B細(xì)胞的增殖均有刺激作用。zui近發(fā)現(xiàn)，integrin家族中VLA組中某些受體與相應(yīng)配體結(jié)合后也能活化T細(xì)胞。根據(jù)形態(tài)學(xué)或氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入率測(cè)定T細(xì)胞的增殖水平。
二、儀器、材料及試劑
1、Beckman LS-9800型液體閃爍計(jì)數(shù)儀，或Beckman LS 6500型液體閃爍計(jì)數(shù)儀。
2、多頭細(xì)胞收集儀。
3、3H-TdR（比活性為2Mci~10Mci/mg分子）。3H-TdR工作液：將1Mci/ml溶液以生理鹽水稀釋成100μci/ml，于4℃保存?zhèn)溆?。臨用時(shí)再用培養(yǎng)液稀釋成10μci/ml溶液。3H-TdR一般臨用時(shí)稀釋。
4、閃爍液：PPO（2，5-二苯基惡唑）、POPOP（1，4-雙-2-15-苯基惡唑苯）Sigma公司。ppo5.0g popop0.1～0.3g 加二甲苯或甲苯至1L；POPOP加入少量二甲苯在37℃水浴上溶解后，再加PPO，然后補(bǔ)足二甲苯。配好的閃爍液需要閉光。閃爍液配制和檢測(cè)的樣品有關(guān)：
5、其他：5%三氯醋酸；3%冰醋酸；濃甲醛；30%H2O2液
三、操作步驟
1、分離淋巴細(xì)胞（可來自外周血，脾細(xì)胞等）
↓
2、洗滌后用10%FCS RPMI1640調(diào)整合適的細(xì)胞數(shù)（2×106／ml）
↓
3、加入96孔培養(yǎng)板中，2×105細(xì)胞／100μl／孔，每組設(shè)3孔
↓
4、加入zui適劑量PHA或Con A，100μl／孔，同時(shí)設(shè)不加PHA或Con A陰性對(duì)照，一般每孔zui終體積為200μl（細(xì)胞終濃度1×105）
↓ 37℃、5% CO2孵育，66h（20h后加藥處理）
5、每孔加入0.5～1μci 3H-TdR（50μl）
↓ 繼續(xù)培養(yǎng)6～12h
6、培養(yǎng)結(jié)束后，離心吸去上清液，用200μl 冷PBS洗滌二次（2000r/min離心10min）用冷PBS可以終止反應(yīng)
↓
7、用DYQ-Ⅱ型多頭細(xì)胞收集儀收集樣品，于"9999"型玻璃纖維濾紙（膜）上。抽洗至少2次。
↓
8、取出濾膜，排列好，置于干燥箱中，60℃~80℃，30min烘干（75℃烤箱過夜）。對(duì)號(hào)剪下各個(gè)濾膜片，然后將濾膜放入裝有5ml的閃爍液中（貼細(xì)胞的面朝上）。閃爍瓶暗處放置15min。
↓
9、β液閃儀（Beckman LS-9800型液體閃爍計(jì)數(shù)儀）計(jì)數(shù)（測(cè)定放射性cpm值）。
↓
10、計(jì)算結(jié)果
①增殖水平直接用每分的脈沖數(shù)cpm值表示，再按標(biāo)本淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，校正成每百萬淋巴細(xì)胞的脈沖數(shù)（cpm/106淋巴細(xì)胞）。取各管測(cè)定數(shù)的平均值。
②也可用刺激指數(shù)（SI）表示試驗(yàn)結(jié)果
Con A/PHA（或?qū)嶒?yàn)組）cpm－機(jī)器本底
SI＝───────────────────────────────
陰性對(duì)照組（不加Con A/PHA）cpm－機(jī)器本底
以SI表示結(jié)果時(shí)，一定要設(shè)置相同數(shù)量培養(yǎng)孔的對(duì)照（即不加Con A/PHA）。而以cpm值表示（cpm/106淋巴細(xì)胞）則可以不用設(shè)對(duì)照管。因?yàn)閷?duì)照的cpm與本底比較接近，不同樣品之間的少許差別也不易確定其意義。
四、注意事項(xiàng)
1、采用手工裁剪大小合適的玻璃纖維膜（Wallac公司）。廢液瓶和真空泵之間加一個(gè)緩沖瓶，不要直接將真空泵上的橡膠管連接到廢液瓶上，以免萬一含3H（氚）的廢液進(jìn)入橡膠管。
2、3ml 5%三固定、5 ml無水乙醇脫水（脫水后濾膜明顯變白）。閃爍液的容水量很低，所以在加入閃爍液之前必須烘干。但加入一定量的醇類（如無水乙醇），則可容納少量的處理后所殘留的水分，但也仍需烘至接近干燥的程度，否則將發(fā)生渾濁而無法測(cè)定。據(jù)報(bào)道，如果閃爍液中加入1/3的異辛基苯氧聚乙氧乙醇（TritonX-100），其容水量可達(dá)15%，消化溶解后的樣品，不必烘干，即可添加閃爍液測(cè)定。
3、PHA、ConA、LPS等在正式實(shí)驗(yàn)前均需摸索zui適劑量或亞適劑量。廠家和批號(hào)不同絲裂原作用常有很大差別。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，對(duì)不同種（人、小鼠、大鼠、兔、狗等）不同來源淋巴細(xì)胞（胸腺、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃腺、外周血等）均應(yīng)進(jìn)行zui適細(xì)胞濃度、培養(yǎng)時(shí)間和刺激物濃度的摸索。
五、單位換算
| Curies 和 d . p . m 的換算： | Curies 和 Becquerels的換算： |
| 1 Curie （ Ci ） =2.22 × 1012 d . p . m . 1 milliCurie （ mCi ） =2.22 × 109 d . p . m . 1 microCurie （ m Ci ） =2.22 × 106 d . p . m . 1 nanoCurie （ nCi ） = 2.22 × 103 d . p . m . 1 picoCurie （ pCi ） =2.22 d . p . m . | 1 Ci = 3.7 × 1010 Bq =37GBq （ gigaBq ） 1 mCi = 3.7 × 10 7 Bq =37MBq （ megaBq ） 1 m Ci = 3.7 × 10 4 Bq =37kBq （ kiloBq ） 1 GBq =2.7 × 10 -4 Ci =27.027mCi （ milliCi ） 1 MBq =2.7 × 10 -7 Ci =27.027 m Ci （ nanoCi ） 1 kBq =2.7 × 10-10 Ci =27.027nCi （ nanoCi ） |
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