文章標(biāo)題：NCI-H1688細(xì)胞 細(xì)胞株培養(yǎng)

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中文名稱：人經(jīng)典小細(xì)胞肺癌細(xì)胞

生長狀態(tài)：貼壁生長

1.試劑和溶液

1）轉(zhuǎn)印緩沖液：0.025M Tris base , 0.187 M甘氨酸 , 25%甲醇

2）氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B

3）1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl ,0.1%Tween 20

4）封閉液：TBST配制的5%牛奶

5）抗體稀釋液：TBST配制的5%牛奶

6）顯色系統(tǒng)：ECL顯色

2.實驗步驟

1電泳：將裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，80v，30分鐘，120v，90分鐘；

2轉(zhuǎn)膜：PVDF膜在甲醇中浸泡約30秒左右，濾紙浸泡在轉(zhuǎn)印緩沖液預(yù)濕，半干法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，10v，150分鐘；

3染色：氨基黑染色5分鐘，甲醇褪去背景色，觀察條帶；

4膜活化：將PVDF膜置于甲醇活化1min，用純水洗膜2次后再用TBST洗滌3次；

5封閉：將膜條置于5%牛奶或2% BSA中，室溫混搖2h；

6一抗孵育：將待檢抗體用3%牛奶或2% BSA稀釋到合適濃度（參照抗體說明書，根據(jù)客戶預(yù)實驗結(jié)果，稀釋度上下浮動一個數(shù)量級都為正常），將膜放入對應(yīng)的已稀釋待檢樣品中，置4℃混搖孵育隔夜；

7洗滌：取出膜放在TBST中洗滌3×5min；

8二抗孵育：將膜取出放入稀釋好的HRP標(biāo)記的二抗（參照二抗說明書進(jìn)行稀釋）中，室溫混搖2h；

9洗滌：取出膜放在TBST中洗滌3×5min；

10ECL顯色：將膜取出放入混勻的ECL顯色液中，孵育3min，將膜取出貼在有熒光角標(biāo)的膠片上，迅速用保鮮膜包好；

11曝光：把底片放在暗盒中，根據(jù)熒光強(qiáng)度分別對X光膠片作不同時間段的曝光，曝光結(jié)束后，將底片取出，1min顯影，30s清洗，1min定影，30s清洗，晾干；

12結(jié)果分析：用掃描儀將曝光后的X光膠片掃描，做后續(xù)結(jié)果分析。

選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時約有105個細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗前，要進(jìn)行預(yù)實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。

注意:細(xì)胞株的生物等級，由于有些細(xì)胞株及菌株屬于管制品，所以從國外購貨比較麻煩。

形態(tài)學(xué)改變:細(xì)胞體積明顯增大,為成熟淋巴細(xì)胞3-4倍。核膜清晰,核染色質(zhì)疏松呈網(wǎng)狀。核內(nèi)見明顯核仁1-4個。胞漿豐富,嗜堿性,有偽足樣突出。胞漿內(nèi)有時可見小空泡。

細(xì)胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細(xì)胞培養(yǎng)室和設(shè)計原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計原則一般是無菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室。

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確保細(xì)胞到每一位用戶手里都是狀態(tài)

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時，膜磷脂酰絲氨酸外翻的發(fā)生早于細(xì)胞核的變化，而此時Propidium Iodide（PI）不能通過細(xì)胞膜。

細(xì)胞壞死時，雖然也會發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻，但此時細(xì)胞膜的通透性明顯增加，PI等核酸染料進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞核中的核酸結(jié)合，發(fā)出紅色熒光。所以Annexin V-FITC(綠色熒光)常與鑒定細(xì)胞死活的核酸染料（如PI）合并使用，來區(qū)分凋亡細(xì)胞與死亡細(xì)胞。

技術(shù)原理及步驟

1. 離心收集細(xì)胞，微量離心機(jī)轉(zhuǎn)速1000 rpm，離心時間5 min，棄培養(yǎng)基。

2. 用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。

3. 用400 μL1× Binding Buffer懸浮細(xì)胞，濃度大約為1×106 cells/mL。

4. 在細(xì)胞懸浮液中加入5 μlLAnnexin V-FITC，輕輕混勻后于2~8°C避光條件下孵育15min。

5. 加入10 μL PI后輕輕混勻于2~8°C避光條件下孵育5 min。

6. 在1小時內(nèi)用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測。

應(yīng)用實例

應(yīng)用領(lǐng)域

細(xì)胞的早期凋亡及區(qū)分凋亡與壞死細(xì)胞

服務(wù)周期

我公司在正式接受實驗委托2個星期左右完成實驗并提供實驗報告。

客戶須知（對材料的要求、注意事項）

需提供細(xì)胞類型，處理條件。

上海試劑銷售供應(yīng)細(xì)胞株細(xì)胞系  部分細(xì)胞產(chǎn)品現(xiàn)貨，復(fù)蘇周期短，平價，狀態(tài)好！！

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