一個(gè)合格的質(zhì)粒含有以下組成部分：

復(fù)制起始位點(diǎn)Ori：即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核生物DNA分子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，而真核生物DNA分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。

抗生素抗性基因：可以便于篩選或檢測(cè)，如Amp+ 、Kan+。

多克隆位點(diǎn)MCS：克隆攜帶外源基因片段。

P/E：?jiǎn)?dòng)子/增強(qiáng)子。

Terms：終止信號(hào)。

加poly(A)信號(hào)：可以起到穩(wěn)定 mRNA 作用。

 如何閱讀質(zhì)粒圖譜：

*步：首先看 Ori 的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）。

第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。

--Ampr   水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性；

--tetr   可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞；

--camr   生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性；

--neor(kanr)   氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 使G418（長那霉素衍生物）失活；

--hygr   使潮霉素β失活。

第三步：看多克隆位點(diǎn)（MCS）。它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)，便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，從而便于篩選。MCS決定了能不能放置目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。

第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，這是用來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體。在克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用哪種載體，要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑橐罁?jù)。

啟動(dòng)子：促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄的DNA序列，這個(gè)DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA分子上可以與RNApol特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。

增強(qiáng)子/沉默子：增強(qiáng)子為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控序列，其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無關(guān)（即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用）。/沉默子：負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。

核糖體結(jié)合位點(diǎn)/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于原核而言是AUG（起始密碼）和 SD序列。

轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的zui后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA的保守序列，此位點(diǎn)down-stream有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly(A）加尾信號(hào)。

為什么質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時(shí)針有的箭頭逆時(shí)針？那其實(shí)是代表兩條DNA鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈 DNA，它的啟動(dòng)子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上。

如何選擇載體

把目的基因通過基因工程手段送到生物細(xì)胞（受體細(xì)胞），需要運(yùn)載工具（交通工具）攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞，這種運(yùn)載工具就叫做載體（vector）。基因工程所用的vector實(shí)際上是用來攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的 DNA。

選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個(gè)特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。

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選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時(shí)約有105個(gè)細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。