染色質免疫沉淀(ChIP)是目前研究體內DNA與蛋白質相互作用的重要工具。雖然ChIP技術的原理不復雜,但是對技術的要求高,實驗步驟的設計摸索耗時耗力,實驗耗費時間長。也許您從未開展過ChIP,也許您的ChIP結果有待改善,那么,可以看看下面的4點建議。
是否需要交聯?
交聯的目的是將感興趣的抗原固定在其染色質結合位點。若沒有交聯的步驟,就意味著只有與染色質結合非常緊密的蛋白質能被免疫沉淀,譬如組蛋白。若您的研究對象是組蛋白,那可能不需要交聯,而其他蛋白,如轉錄因子和DNA結合復合物中包含的蛋白,可能還需要交聯。如果使用交聯,則ChIP反應被稱為X-ChIP,則天然的ChIP反應被稱為N-ChIP。然而,確實有一些抗原不適合用X-ChIP這種方式,因為在交聯過程中它們的表型會發生變化,或出現包涵體。
片段化要小心
染色質必須片段化,才能讓相互反應接觸到抗體。無論您采用哪種方法,都必須確保一定的片段化時間進程。對于X-ChIP,超聲波處理是必需的,因為甲醛交聯限制了酶切的效果。超聲波處理的條件要自己來優化,不過說明書上通常都會給出一個參考條件。超聲波產生了隨機的DNA片段(平均500-700 bp)。在開展N-ChIP時,微球菌核酸酶的消化可產生~175 bp的單體。酶切消化的優勢在于消化的重復性好,易控制反應。
抗體用對沒有?
如果可以的話,使用經過充分驗證、ChIP級別的抗體。當然,這種抗體并不多。如果沒有,也可以選擇普通的免疫沉淀抗體,或能夠識別天然表位的抗體。一般來說,多克隆抗體是個更好的選擇,因為單克隆抗體只識別單個表位,而這個表位有可能在交聯過程中被掩蓋。而另一方面,單克隆抗體卻往往有著更好的批間一致性。抗體的量和使用的條件都應根據使用經驗來確定。一般情況下可以從每50ug DNA使用2-5ug抗體作為起始條件開始摸索。
對照也很重要
作為ChIP技術的陽性對照,H3K4me3和H3K9me3分別適用于激活和失活的基因。作為陰性對照,可選擇一個識別非染色質表位的抗體,如GFP抗體。但要記住,這些抗體本身不是陽性和陰性對照,因為這取決于您正在研究的位點。如果在您研究的位點無H3K4me3,即使是的ChIP級別的H3K4me3抗體也不能讓任何東西免疫沉淀,那么這就不是一個理想的陽性對照。如果您的實驗室剛剛開始用ChIP,考慮購買試劑盒。
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