細胞培養 支原體污染問題    

細胞壁，可透過一般過濾膜(0.22-0.45 um)的原核生物，在細胞培養過程中，支原體感染發生率達到63%，因而細胞培養過程中被支原體污染是一個世界性的難題。當細胞(特別是傳代細胞)被支原體污染后，細胞內的DNA、RNA及蛋白表達發生改變，而細胞的生長率一般并未發生顯著的影響，因而細胞被支原體污染一般難以察覺。

支原體污染的后果：

細胞株若受到細菌、真菌、支原體、或是特定病毒等之污染時，會嚴重的影響實驗的結果。而細菌、真菌等之微生物污染時，較易自培養基等的外觀變化察覺。但是若受到支原體之污染時，細胞之外觀較無明顯變化，但是其污染會造成細胞之生長速率緩慢、細胞產生病變之型態改變等等變化。

支原體污染 如何預防和控制：

設備方面:

1、使用已作支原體測試ok之細胞株

2、于另一隔離之區域操作未知是否有支原體污染之細胞

3、使用不添加抗生素的培養基培養細胞

檢測方面:定期以標準的支原體檢測方法檢測細胞、培養基、血清、ddH2O有否被支原體污染。

實驗操作人員之無菌觀念與無菌操作技術之要求

支原體污染問題：

1、應如何避免細胞污染?

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原體。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之方法。

2、如果細胞發生微生物污染時，應如何處理?

直接滅菌后丟棄之。

3、支原體(mycoplasma) 污染的細胞，是否能以肉眼觀察出異狀?

不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。

4、支原體污染會對細胞培養有何影響?

支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數，代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。

5、偵測出細胞株有支原體污染時，該如何處理?

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。

支原體檢測：

直接培養法

原理:直接培養支原體于培養基中，觀察其生長及菌落生成。

特點:是目前zui直接與靈敏之步驟，亦是用來評估其它偵測新步驟之標準步驟。

缺點:培養時間長，須3-5星期才能判斷。有些支原體不能在培養基培養出來(例如M. hyorhinis)。需同時培養支原體株作為正反應對照組，可能會造成污染。

材枓:dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、無菌有蓋螺旋試管(autoclaved)、無菌培養皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培養箱、厭氧缸(厭氧缸長期培養易有污染，所以厭氧包應用無菌水，每次打開厭氧缸后，用70% ethanol擦拭內壁。)

培養基制備:

基本配方為Difco PPLO broth(60%), 馬血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培養時間長，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1:2000)至培養基中以防止其它細菌污染。

· 10x stock solution (1 liter) :稱取50 gdextrose，10 gL-arginine HCl，溶于1 liter蒸餾水中。以0.22μm無菌過濾膜過濾滅菌。分裝100 ml至瓶中，保存于-70℃。

· 液體培養基(1 liter) :稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 gphenol red 于600ml蒸餾水中，加熱攪拌溶解之。滅菌121℃，15分鐘。待溫度降低至室溫后，于無菌操作臺內加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均勻后，分裝至已滅菌之有蓋螺旋試管中，10ml/管。保存于4℃，期限1個月。

· 固體培養基(1 liter ):稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 gphenol red，15gBacto agar于600ml蒸餾水中，加熱溶解之。滅菌121℃，15分鐘。放在50℃水中浴中，待溫度降低至50℃時，于無菌操作臺內加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解凍之10x stock solution，混合均勻后，倒入60x50㎜之無菌培養皿中，5ml/培養皿。保存于4℃，期限1個月。

步驟:

· 取1 ml細胞培養液或0.2ml細胞懸浮液，接種于液體培養基中，置于37℃培養二周，觀察是否有混濁或是pH值改變之情形。培養一周及二周后，分別取0.1 ml液體培養液涂在agar plate上，將其倒放置于37℃厭氧箱培養，培養至少3星期，持續觀察是否有支原體之菌落出現。

· 另取1 ml細胞培養液或0.2ml細胞懸浮液，涂抹在agar plate上，37℃厭氧培養3星期，持續觀察是否支原體菌落出現。

· 另作正負反應對照組，正反應對照組為Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 與M. arginini (ATCC 23838)。負反應對照組為待測細胞之新鮮培養基。

結果判讀：

· 支原體生長較慢，所以先在液體培養基培養1~2周增殖后，再培養于agar plate上。需至少培養3星期后，才可斷定是否有支原體污染。所以整個測試需5個星期才知正確結果。

· 典型之支原體菌落類似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原體往agar下層生長所致，為圓形無色透明菌落，大小約10-55μm。但是并非所有的支原體皆為似荷包蛋菌落，有些是圓形菌落或是類似粘菌類形態(slime)。

· 若要區分細胞或是氣泡造成的類似菌落，可將其自agar plate上切下，重新培養于液體培養基中，培養一星期后再種入agar plate，若是細胞則不會生長。