Southern Blot原理及實驗方法    SDS-PAGE實驗原理:

   聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺 (簡稱Acr) 和交聯劑N，N’—亞甲基雙丙烯酰胺（簡稱Bis）在催化劑作用下，聚合交聯而成的具有網狀立體結構的凝膠，并以此為支持物進行電泳。 

人乳腺癌細胞，Hs 578T細胞  
人乳腺癌細胞，MDA-MB-468-06細胞 
聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據不同蛋白質分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產生的不同遷移率將蛋白質分離成若干條區帶，如果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質，蛋白質樣品電泳后，就應只分離出一條區帶。

人胚肺二倍體細胞，2BS細胞（T25培養瓶@密度75%） 
人支氣管上皮樣細胞，BEAS-2B細胞
SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質分子結合成復合物，使蛋白質帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。

人典型小細胞肺癌細胞，NCI-H1688細胞（T25培養瓶@密度75%）
人非小細胞肺癌細胞，NCI-H1299細胞（T25培養瓶@密度75%）

因此，各種蛋白質-SDS 復合物在電泳時的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只是棒長的函數。這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱SDS—PAGE）。

人肺腺癌細胞 SPC-A1細胞 規格（T25培養瓶@密度75%）
人肺癌細胞 A549細胞 規格（T25培養瓶@密度75%）
由于SDS-PAGE 可設法將電泳時蛋白質電荷差異這一因素除去或減小到可以略而不計的程度，因此常用來鑒定蛋白質分離樣品的純化程度，如果被鑒定的蛋白質樣品很純，只含有一種具三級結構的蛋白質或含有相同分子量亞基的具四級結構的蛋白質，那么SDS—PAGE 后，就只出現一條蛋白質區帶。

人肺癌細胞 TKB-1細胞 規格（T25培養瓶@密度75%）
人肺腺癌細胞，LTEP-a-2細胞 規格（T25培養瓶@密度75%）
SDS—PAGE 可分為圓盤狀和垂直板狀、連續系統和不連續系統。本實驗采用垂直板狀不連續系統。所謂“不連續”是指電泳體系由兩種或兩種以上的緩沖液、pH 和凝膠孔徑等所組成。

人非小細胞肺癌細胞 H125細胞 規格（T25培養瓶@密度75%）
人肺癌細胞 H1299細胞 規格（T25培養瓶@密度75%）

樣品的濃縮效應：在不連續電泳系統中，含有上、下槽緩沖液(Tris—Gly，pH8.3)、濃縮膠緩沖液(Tris—HCl，pH6.8)、分離膠緩沖液(Tris—HCl，pH8.8)，兩種凝膠的濃度(即孔徑)也不相同。
在這種條件下，緩沖系統中的HCl 幾乎全部解離成Cl－，兩槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解離成Gly 的負離子，而酸性蛋白質也可解離出負離子。這些離子在電泳時都向正極移動。
C1—速度zui快(先導離子)，其次為蛋白質，Gly 負離子zui慢(尾隨離子)。

人肺腺癌細胞，Lu-165細胞 規格（T25培養瓶@密度75%）
人大細胞肺癌細胞，NCI-H460細胞 規格（T25培養瓶@密度75%）
由于C1—很快超過蛋白離子，因此在其后面形成一個電導較低、電位梯度較陡的區域，該區電位梯度zui高，這是在電泳過程中形成的電位梯度的不連續性，導致蛋白質和Gly 離子加快移動，結果使蛋白質在進入分離膠之前，快、慢離子之間濃縮成一薄層，有利于提高電泳的分辨率。

人肺腺癌細胞，SPC-A-1細胞 規格（T25培養瓶@密度75%）
人高轉移肺癌細胞，095-D細胞（T25培養瓶@密度75%）

分子篩效應：蛋白質離子進入分離膠后，條件有很大變化。由于其pH 升高(電泳進行時常超過9.0)，使Gly 解離成負離子的效應增加；同時因凝膠的濃度升高，蛋白質的泳動受到影響，遷移率急劇下降。

人肺鱗癌細胞，SK-MES-1細胞（T25培養瓶@密度75%）
人大細胞肺癌細胞，NCI-H661細胞（T25培養瓶@密度75%）
人肺黏液上皮樣癌細胞，NCI-H292細胞 
此兩項變化，使Gly 的移動超過蛋白質，上述的高電壓梯度不復存在，蛋白質便在一個較均一的pH 和電壓梯度環境中，按其分子的大小移動。
分離膠的孔徑有一定的大小，對不同相對分子質量的蛋白質來說，通過時受到的阻滯程度不同，即使凈電荷相等的顆粒，也會由于這種分子篩的效應，把不同大小的蛋白質相互分開。

人肺退行性癌細胞，Calu-6細胞（T25培養瓶@密度75%） 
人肺腺癌細胞，NCI-H1395細胞（T25培養瓶@密度75%）
人非小細胞肺癌細胞，NCI-H358細胞（T25培養瓶@密度75%
人非小細胞肺癌細胞，HCC827細胞（T25培養瓶@密度75%）

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