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單向定量免疫電泳實驗

來源:上海彩佑實業有限公司   2015年08月19日 14:53  

實驗方法原理    火箭電泳(rocketimmunoelectrophoresis)又稱單向定量免疫電泳,將抗原樣品放在含有專一性抗體的凝膠孔中,抗體靜電荷為零不移動;而抗原分子在電場作用下移動,形成抗原-抗體復合物沉淀下來。后面的抗原繼續向正極泳動遇到沉淀的抗原-抗體復合物,抗原過量使復合物沉淀溶解,與未結合的抗體結合,又形成新的抗原-抗體復合物沉淀下來,不斷沉淀-溶解-再沉淀,zui后形成錐形的沉淀峰,稱火箭電泳。其高度與所加抗原的量大致成比例。
(來源:生物化學與分子生物學實驗指導,邵雪玲等,武漢大學出版社,2003)
實驗材料    人IgG 兔抗人IgG
試劑、試劑盒    瓊脂
儀器、耗材    玻璃板 電泳儀 水平電泳槽 打孔器 微量加樣器 恒溫水浴鍋
實驗步驟    
1. 抗體瓊脂板的制備
 
將融化的瓊脂冷卻到55 ℃,加入適量(看免疫血清的效價高低而定)的抗體,立即混勻(不要出現泡沫),將上述的抗體瓊脂(大約20 ml)制成瓊脂板,冷卻后按下圖打孔備用。

 
2. 加樣
 
在各孔里加入按二倍連續稀釋法稀釋的抗原。
 
3. 電泳
 
通電后調電壓為10 V/cm,或電流強度為2~4 mA/cm,時間約1~5小時。
 
4. 觀察
 
在電場作用下,定量的抗原在含有定量的瓊脂中泳動后,比例合適時,可在短時間內出現錐形沉淀,此沉淀線形似火箭,抗原濃度越高,“火箭”面積愈大。但抗體效價要高。
 
5. 定量抗原

在電泳一定時間后可以觀察到火箭狀的白色沉淀峰。電泳完畢后,測定沉淀峰的高度,用圓規仔細測量沉淀峰zui與樣品孔中心間的距離,記錄結果。以標準樣品即不同抗原濃度為橫坐標,以沉淀峰的高度為縱坐標繪制標準曲線。根據量得的待測抗原沉淀峰的長度,從標準曲線查出相應抗體含量,在乘以樣品稀釋倍數即可計算出該抗原的含量。
收起 
注意事項    
如果計算,可用求積儀測定峰的面積。影響單向定量免電泳的因素很多,主要是要選擇好抗體濃度,使抗原抗體濃度比例合適。這就需要根據免疫血清的效價來定所加入瓊脂中的抗體量,如效價高,則免疫血清瓊脂的比例為1∶5~9,如效價低;;則免疫血清與瓊脂的比例為2∶5。另外,抗原含量也要注意,過高過低都影響火箭峰形。如抗原含量過低,則峰形太矮,如抗原濃度過高,則火箭峰不封口。如抗原抗體量合適,泳動的距離大約為2~5 cm。

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