二、緩沖液

免疫細胞化學中應用的緩沖液種類較多，即使是同種緩沖液，其濃度、pH、離子強度等也常常不同。在此介紹幾種zui常用的緩沖液的配制。

1．0.2mol/L(pH7.4)磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer, PB）

試劑： NaH2PO4·2H2O

Na2HPO4·12H2O

配制方法：配制時，常先配制0.2mol/L的 NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，兩者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液（PB），根據(jù)需要可配制不同濃度的PB和PBS。

（1）0.2mol/L的 Na2HPO4；稱取Na2HPO4.12H2o 31.2g(或 NaH2PO4·H2O 27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。

（2）0.2mol/L的 Na2HPO4：稱取NaHPO4.·12H2o 71.632g（或 Na2HPO4·7H2O 53.6g或Na2HPO4·2H2o 35.6g）加重蒸水至1000ml溶解。

（3）0.2mol/L pH7.4的PB的配制：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4和81ml 0.2mol/L的Na2HPO4·12H2O,充分混合即為0.2mol/L的PB（pH約為7.4～7.5）。若pH偏高或偏低，可通過改變二者的比例來加以調(diào)整，室溫 保存即可。

2．0.01mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水（Phosphate Buffered Saline, PBS）

試劑：0.2mol/L PB 50ml

NaCl 8.5～9g(約0.15mol/L)

重蒸水 至1000ml

配制方法：稱取NaCl 8.5～9g及0.2mol/L的PB 50ml，加入1000ml的容量瓶中，zui后加重蒸水至1000ml，充分搖勻即可。若擬配制0.02mol/L的PBS，則PB量加倍即可，依此類推。

PB和PBS是免疫細胞化學實驗中zui為常用的緩沖液，0.01mol/L的PBS主要用于漂洗組織標本、稀釋血清等，其pH應在7.25～7.35之間，否則需要調(diào)整。0.1mol/L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。一般情況下，0.2mol/l PB的pH值稍高些，稀釋成0.01mol/L的PBS時，常可達到要求的pH值，若需調(diào)整pH，通常也是調(diào)PB的pH。

3．Karasson –Schwlt’s磷酸鹽緩沖液

試劑： NaH2PO4·H2O 3.31g

Na2HPO4·7H2O 33.77g

重蒸水 至1000ml

配制方法：同前

該緩沖液主要用于配制Zamboni’s固定液。

4．0.5mol/L pH7.6的Tris- HCl緩沖液。

試劑：Tris(三羥甲基氨基甲烷) 60.57g

1N HCl 約420ml

重蒸水 至1000ml

配制方法：先以少量重蒸水（300～500ml）溶解Tris,加入HCl后，用1N的HCl或1N的NaOH將pH調(diào)至7.6，zui后加重蒸水至 1000ml。此液為儲備液，于4℃冰箱中保存。免疫細胞化學中常用的Tris-HCl緩沖液濃度為0.05mol/L，用時取儲備液稀釋10倍即可。

該液主要用于配制Tris緩沖生理鹽水（TBS）、DAB顯色液。

5．Tris緩沖生理鹽水（Tris Buffered,Saline,TBS）

試劑：0.5mol/L Tris-HCl緩沖液 100ml

NaCl 3.5～9g(0.15mol/L)

重蒸水 至1000ml

配制：先以重蒸水少許溶解NaCl,再加Tris-HCl緩沖液，zui后加重蒸水至1000ml，充分搖勻使Tris終濃度為0.05mol/L。

TBS主要用于漂洗標本，常用于免疫酶技術(shù)中。

6．Tris-TBS(PBS)

試劑：Triton X-100 10ml(1%)或3ml(0.3%)

0.5mol/L Tris緩沖液（pH7.6） 1000ml(50ml)或(0.2mol/L的PB)

NaCl 8.5～9g

重蒸水 至1000ml

配制方法：先以重蒸水少許溶解NaCl后，加入Triton X-100及Tris緩沖液或（PB），zui后加重蒸水至1000ml，充分搖勻。

該液常用濃度為1%及0.3%，前者主要用于漂洗標本，后者主要用于稀釋血清。

7．0.1mol/L（pH7.4）二甲胂酸緩沖液

試劑：0.2mol/L二甲胂酸鈉 500ml

0.1N HCl 28ml

蒸餾水 至1000ml

配制方法：先稱取二甲胂酸鈉（MW：214）42.8g,加蒸餾水至1000ml，使0.2mol/L的二甲胂酸鈉溶液；再取HCl1.7ml加蒸餾水至1000ml ,配成0.1N，zui后 取0.2mol/L二甲胂酸鈉溶液500ml及0.1n HCl 28ml混合，加蒸餾水至1000ml，即為0.1mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液。

8．幾種常用的不同pH值緩沖液的配制表

（1）0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH5.7～8.0）

pH
0.2mol/L NaH2PO4(ml)
0.2mol/L Na2HPO4(ml)

5.7
93.5
6.5

5.8
92.0
8.0

5.9
90.0
10.0

6.0
87.7
12.3

6.1
85.0
15.0

6.2
81.5
18.5

6.3
77.5
22.5

6.4
73.5
26.5

6.5
68.5
31.5

6.6
62.5
37.5

6.7
56.5
43.5

6.8
51.0
49.0

6.9
45.0
55.0

7.0
39.0
61.0

7.1
33.0
67.0

7.2
28.0
72.0

7.3
23.0
67.0

7.4
19.0
81.0

7.5
16.0
84.0

7.6
13.0
87.0

7.7
10.5
89.5

7.8
8.5
91.5

7.9
7.0
93.0

8.0
5.3
94.7

(2)0.05mol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.19～9.10）

pH
0.2mol/L Tris(ml)
0.2mol/L HCl(ml)
H2O

7.19
10.0
18.0
12.0

7.36
10.0
17.0
13.0

7.54
10.0
16.0
14.0

7.66
10.0
14.0
15.0

7.77
10.0
14.0
16.0

7.87
10.0
13.0
17.0

7.96
10.0
12.0
18.0

8.05
10.0
11.0
19.0

8.14
10.0
10.0
20.0

8.23
10.0
9.0
21.0

8.32
10.0
8.0
22.0

8.41
10.0
7.0
23.0

8.51
10.0
6.0
24.0

8.62
10.0
5.0
25.0

8.74
10.0
4.0
26.0

8.92
10.0
3.0
27.0

9.10
10.0
2.0
28.0

(3)0.2mol/L醋酸鹽緩沖液（pH3.6～5.6）

pH
0.2mol/L醋酸（ml）
0.2mol/L醋酸鈉（ml）

3.6
46.3
3.7

3.8
44.0
6.0

4.0
41.0
9.0

4.2
36.8
13.2

4.4
30.5
19.5

4.6
25.5
24.5

4.8
20.0
30.0

5.0
14.8
35.2

5.2
10.5
39.5

5.4
8.8
41.2

5.6
4.8
45.2

(4)0.1mol/L二甲胂酸鈉緩沖液（pH5.0～7.4）

pH
0.2mol/L二甲胂酸鈉（ml）
0.2N HCl(ml)
蒸餾水

5.0
25
23.5
51.5

5.2
25
22.5
52.5

5.4
25
21.5
53.5

5.6
25
19.6
55.5

5.8
25
17.4
57.5

6.0
25
14.8
60.3

6.2
25
11.9
63.1

6.4
25
9.2
65.8

6.6
25
6.7
68.3

6.8
25
4.7
70.3

7.0
25
3.2
71.8

7.2
25
2.1
72.9

7.4
25
1.4
73.6

注：HCI可由NCO3代替，配制成二甲胂酸鈉-HNO3緩沖液。

（5）0.2mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.2～10.7）

pH
0.2mol/L Na2CO3(ml)
0.2mol/L NaHCO3(ml)

9.2
4.0
46.0

9.3
7.5
42.5

9.4
9.5
40.5

9.5
13.0
37.0

9.6
16.0
34.0

9.7
19.5
30.5

9.8
22.0
28.0

9.9
25.0
25.0

10.0
27.5
22.5

10.1
30.0
20.0

10.2
33.0
17.0

10.3
35.5
14.5

10.4
38.5
11.5

10.5
40.5
9.5

10.6
42.5
7.5

10.7
45.0
5.0

三、顯色液

免疫細胞化學中，由于抗原-抗體反應所形成的復合物本身無色，無法直接觀察，因而需借助于某些化學基團的呈色作用，使其得以顯示，以利于在顯微鏡下觀察。常用的顯色液有：

1．DAB（Diaminobenzidine）顯色液

DAB即3，3-二氨基苯聯(lián)胺

試劑：DAB（常用四鹽酸鹽） 50mg

0.05mol/L TB 100ml

30% H2O2 30～40μl

配制方法：先以少量0.05mol/L(pH7.6)的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分搖勻，使DAB終濃度為0.05%,過濾后顯色前加入30%的H2O230～40μl，使其終濃度為0.01%。

DAB顯色液主要用于免疫過氧化物酶法（如酶標法、PAP法等），其終產(chǎn)物可直接在光鏡下觀察，也可經(jīng)OsO4處理后，增加反應產(chǎn)物的電子密度，用于電鏡觀察。但有幾點需注意：DAB溶解要*，否則未溶解的顆粒沉積于標本上影響觀察；DAB濃度不易過高，否則顯色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB 有致癌作用，故操作時應戴手套，盡量避免與皮膚接觸，用后及時*沖洗，接觸DAB的實驗用品經(jīng)洗液浸泡24h后使用。

2．4-氯-1-萘酚（4-Cl-1-Naphthol）顯色液

配方1：4-Cl-1-萘酚 100mg

純乙醇 10ml

0.05mol/L TB(pH7.6) 190ml

30% H2O2 10μl(0.003%)

配制方法：先將4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后加入Tb 19ml，用前加入30% H2O2使其終濃度為0.005%，切片顯色時間通常為5～20min。

配方2：4-Cl-1-萘酚

N-二甲基甲酰胺（DMF）

0.05mol/L TB(pH7.6)

30% H2O2

配制方法：先將4-Cl-1-萘酚加入DMF中，加熱溶解使呈乳白色，再加入TB，乳白色變?yōu)樾鯛睿?.5℃加熱5min后加入H2O2，攪動使絮 狀消失，趁熱過濾，當降至略低于50℃時才放入組織標本（注意：溫度過高易損傷標本，過低則易重新出現(xiàn)沉淀）。顯色時間通常為5min左右。

4-Cl-1-萘酚的終產(chǎn)物顯示藍色。

多數(shù)認為去除白色沉淀（如上述），但Larsson等認為，白色沉淀可作為背景，使陽性部位更易觀察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚顯色的組織標本，勿用酒精脫水。

3．3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole,AEC）顯色液

試劑：AEC 20mg

二甲基甲酰胺（DMF） 2.5ml

0.05mol/L醋酸緩沖液（pH5.5） 50ml

30%H2O2 25ml

配制方法：先將AEC溶于DMF中，再加入醋酸緩沖液充分混勻。臨顯色前，加入30%H2O2。切片顯色時間為5～20min。

該顯色液作用后，陽性部分呈深紅色，加以蘇木精或亮綠等作為背景染色，則效果更佳。由于終產(chǎn)物溶于酒精和水，故需用甘油封固。

4．TMB顯色液

試劑：TMB

HCl

*

配制方法：

（1）醋酸鹽緩沖液：取1.0mol/L的HCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸鈉400ml中混合，再加蒸餾水稀釋至1000ml，用醋酸或NaOH將pH調(diào)至3.3。

（2）A液：取上述緩沖液5ml，溶解100mg亞硝基，加蒸餾水92.5ml混合。

（3）B液：稱取5mg TMB加入2.5ml*中，可加熱至37℃～40℃直到TMB*溶解。

（4）孵育液：放入標本前數(shù)秒，取2.5ml B液及97.5ml A溶于試管中充分混合。（液體在20min內(nèi)應保持清亮的黃綠色，否則可能已有污染）。酶反應時，加入終濃度為0.005%的H2O2。

（5）主要顯色步驟：組織標本在蒸餾水（或PBS）中漂洗數(shù)次（每次約10～15min）后放入未加H2O2的孵育液中作用20min（19℃～30℃），然后向孵育液中放入H2O2（每100ml孵育液中加0.3%的H2O21.0～5.0ml）繼續(xù)孵育液20min左右（19℃～23℃），撈出標本漂洗數(shù)次（共30min左右）。在0～4℃條件下可在漂洗液放置4h直至貼 片、脫水，封片。也可在貼片前在1%的中性紅中負染2～3min，也可在1%派諾寧（pH3.3～3.5）中負染5min后貼片、脫水、封片。

TMB即四甲基聯(lián)苯胺（Tetrabenzidine）是一種脂溶性較強的基團，因此容易進入細胞與細胞器中的HRP反應，且由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在HRP活性部位產(chǎn)生粗大的、深蘭色沉淀物，這使得TMB成為組化實驗中的一種很好的發(fā)色團。同時反應產(chǎn)物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反應進行。TMB的反應產(chǎn)物為深藍色，利于光鏡觀察，且反應產(chǎn)物越聚越大，常超出單個細胞器的范圍（而DAB則被限制在其內(nèi)），故TMB反應的檢測閾較低。由于上述優(yōu)點，目前TMB常用于光鏡及超微結(jié)構(gòu)水平的HRP及HRP-WGA神經(jīng)投射的研究。需要注意的是：TMB顯色液中的A 液和B液應在2h內(nèi)新鮮配制。另外，TMB是一種較強的皮膚刺激劑，并有致癌的潛在可能，故使用時應帶手套及在通風條件下操作。

5．NBT顯色液

試劑A液：5%NBT：稱 取0.5gNBT溶于10ml 70%的DMF（二甲基甲胺）內(nèi)，充分混合，常存于4℃，也可裝成小份，-20℃保存，用前復溫。

B液：5% BCIP：稱取BCIp 0.5g溶于10ml 100%的DMF內(nèi)，混勻。4℃或分裝存于-20℃，用前恢復至室溫。

C．顯色液：取A液40μl，加入到盛有10ml的0.1mol/l Tris-HCl(pH9.5,鈐0.1mol/LNaCl、5mmol/L MgCl2)管內(nèi)，充分混勻；再加入B液40μl，輕輕混合即可。用前新鮮配制。

NBT即四唑氮藍（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818,為深藍色無定形微溶物質(zhì)。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）。當二者存在時，在堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase, AP）作用下，NBT被還原形成顯微鏡下可見的藍色或紫色沉淀。

四、粘附劑

在免疫細胞化學工作中，由于標本（如切片）的脫落常影響工作的質(zhì)量的速度，故粘附劑的選擇和使用就顯得較為重要。

1．鉻礬明膠液

試劑：鉻礬 0.5g

明膠（Gelatine） 5g

H2O ~1000ml

方法：在1000ml的燒杯或燒瓶中，以500～800ml H2O加溫溶解明膠，待其*溶解后，再加入鉻礬。注意溫度過高易使明膠燒糊，包被玻片時控制水溫在70℃。如有明顯殘渣，過濾后使用。

2．甲醛-明膠液

試劑：40%甲醛 2.5ml

明膠 0.5g

蒸餾水 至100ml

配制方法：用少許蒸餾水（約80ml）加熱溶解明膠，待*溶化后，加入甲醛，zui后補充蒸餾水至100ml混勻即可。

3．多聚賴氨酸（Poly-L-Lycine,PLL）

試劑：多聚賴氧酸 5g

蒸餾水 ~1000ml

配制方法：稱取PLL，溶于H2O，充分混合即可，此液濃度為0.5%，可適當稀釋配成0.01～0.5%濃度。4℃保存，也可-20℃?zhèn)溆谩LL可反復冰凍，效果無明顯影響，工作液常再稀釋10～50倍。

4．Vectabond試劑 該試劑是Vector公司新進推出的一種新型玻片粘附劑。該試劑與一般的粘附劑不同，它是通過對玻璃表面起化學修飾作用，改變其表面的化學物理特性，使組織切片牢固地貼于玻璃片上，貼上后不易脫落，保留時間較久。一個試劑盒（7ml）可配成350ml工作液（用丙酮 配）。處理載玻片前（事先酸處理），用染色缸裝好各種液體，按下列程序進行：

干凈載玻片→丙酮5min→Vectabond試劑工作液（7ml Vectabond+ 350ml丙酮）：將載玻片用鑷子夾住浸入Vectabond試劑1～2次→dH2O，2×5min→干燥（37℃）→用鋁箔包好，室溫存放備用。

注意：避免污染（塵埃等）。

綜上述方法處理的載片一般可存放半年以上。

五、封固劑
1．甘油-TBS及甘油-PBS

配制方法：按比例將甘油和TBS（或PBS）充分混合后，置4℃，冰箱靜止；待氣泡排除后方可使用。

2．甘油-明膠（凍）

試劑：明膠 10g

甘油 12ml

蒸餾水 100ml

香草酚 少許

配制方法：稱取1g明膠于溫熱（約40℃）的蒸餾水中，充分溶解后過濾，再加入12ml甘油混合均勻。少許香草酚是為了防腐。

3．液體石蠟 液體石蠟因含雜質(zhì)少，很少引起非特異性熒光，故常用于熒光組化及免疫熒光法時標本的封固。

4．DPX

試劑：Distrene 10g

酸二丁 5ml

二甲苯 35ml
DPX 為中性封固劑，用于多種染色方法勻不易褪色，但組織收縮較明顯，故應盡量使其為均勻的一薄層。DPX現(xiàn)有商品出售，可直接應用。若感過于粘稠，也可加少量 二甲苯稀釋后應用。注意：二甲苯不可加得太多，二甲苯揮發(fā)后，片子上出現(xiàn)許多干燥的空泡，影響觀察，遇有這種情況，可用二甲苯浸泡掉蓋玻后重新封固。

六、酶消化液

1．0.1%胰蛋白酶

試劑：胰蛋白酶 0.1gm

0.1%氯化鈣（pH7.8） 100ml

配制方法：先配制0.1%的CaCl2,用0.1mol/L的NaOH將其pH調(diào)至7.8，然后加入蛋白酶溶解之。用前將胰蛋白酶消化液在水浴中予熱至37℃（載有標本的玻片也在TBS中予熱至同樣樣溫度）。該消化液時間約為5～30min。

2．0.4%胃蛋白酶

試劑：胃蛋白酶 400mg

0.1N HCl 100ml

配制方法：同胰蛋白酶。消化時間在37℃約為30min。

3．0.06% Pronase

試劑：Pronase 0.06g

0.05mol/L TB(pH7.5) 100ml

配制方法：同前。

在免疫細胞化學染色中，有時經(jīng)Formalin過度固定的標本，常會產(chǎn)生過量的醛基，遮蓋抗原，影響一抗與抗原的結(jié)合。用蛋白酶溶液消化，可起到暴露 抗原部分的作用。消化時間應根據(jù)不同組織而異，總之，在保持組織形態(tài)不被破壞的前提下，宜盡量延長消化時間。以上三種酶消化液中，以*種zui為常用。

七、其它

1．蔗糖溶液 免疫細胞化學中應用的蔗精，常用濃度為5%～30%。一般光鏡研究，僅用20%蔗糖處理已足矣，若制備電鏡標本，在冰凍前經(jīng)上行蔗糖（5%、10%、15%、20%及20%蔗糖-5%甘油等）處理，以確保其良好的細微結(jié)構(gòu)。

（1）20%蔗糖液：

試劑：蔗糖 20g

0.1mol/L PB(pH7.5) 至100ml

配制方法：先以少許0.1mol/L的PB溶解蔗糖，再加0.1mol/l PB至100ml充分混合，置4℃冰箱保存。

該液多用于純光鏡研究。標本在剛放入濃度如此高的蔗糖液，常浮在上面，當標本沉到底部時即可。通常光鏡標本浸泡在20%蔗糖液中。都能達到要求。

（2）20%蔗糖-5%甘油：

試劑：蔗糖 20g

甘油 5ml

0.1mol/L PB 至100ml(約95ml)

配制方法：先用少許PB溶解蔗糖后，再加入甘油，充分混勻，zui后補足PB至100ml，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

該液主要用于電鏡標本的處理，常浸泡（其它濃度的蔗糖中常分別為2h左右）。

蔗糖是一種廉價的防凍劑，兼有脫水的作用，它可減小標本在冰凍切片時冰晶形成的數(shù)量和大小，應用較