煙酰胺核苷酸轉氫酶抗體實驗方法原理    ELISPOT技術原理，一句話概括就是：用抗體捕獲培養中的細胞分泌的細胞因子，并以酶聯斑點顯色的方式將其表現出來。
實驗材料    細胞
試劑、試劑盒    PBS PBST乙醇包被抗體 封閉液 抗體稀釋液 檢測抗體 酶聯親和素 AEC顯色液PHA刺激物 U-Cytech無血清培養基
儀器、耗材    ELISPOT讀數儀 超凈工作臺 細胞培養箱 移液器 槍頭 離心管ELISPOT板
實驗步驟    
一、ELISPOT包被 
 
1.  設計好實驗，把每個孔要加入的內容做成卡片，到時候就會從容很多。
 
2.  每孔加入15 μL 70%的乙醇預濕30秒。
 
3.  加入100 μL去離子水洗滌三次，盡量減少乙醇的殘留。
 
4.  按照試劑盒的使用說明，將包被抗體儲存液稀釋在PBS緩沖液中，每孔加入50 μL，4°C包被。
 
5.  （次日）傾倒包被液，用PBS洗滌5次，zui后一次，在滅菌的吸水紙上扣干。
 
6.  加入200 μL試劑盒自帶的稀釋好的封閉液，37°C封閉1小時。
 
7.  傾倒封閉液，無須洗滌，直接可以進行細胞培養。（也可以用PBS緩沖液或者純水洗滌一次，拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存數周。）
 
二、鋪細胞，加入刺激物，培養 
 
整個實驗設置一組正對照（PHA刺激），每一個細胞樣品（同一個捐獻者或者實驗動物）要設一個負對照（不加刺激物），整塊板還要加一個背景負對照（不含細胞，只加培養基和所有的檢測試劑）。
 
1.  填好實驗卡片，用以指導實驗的安排和細胞及試劑的添加。每一個細胞/刺激物的組合設置2-4個孔的重復（想要有統計學的意義，每個細胞/刺激物設4個孔的重復）。
 
2.  取出封閉好的板，準備加入細胞。如果是以前做的封閉，可以加入200 μL的U-Cytech無血清培養基，室溫靜置10分鐘，傾倒，然后再重復一次。
 
3.  按照實驗卡片的安排，加入不同濃度的細胞，100 μL/well，細胞在孔中的分布要盡量均勻（要訣是加入細胞之后，不要再震動或者拍擊ELISPOT板。有人認為拍擊板子會讓細胞更分散，實際情況剛好相反）。正對照的細胞濃度為1x105/well，實驗組的樣品細胞濃度請自行調整。
 
4.  加入100 μL的U-Cytech無血清培養基到背景負對照孔。
 
5.  正對照孔加入10 μL PHA，終濃度4 ug/mL，該濃度能有效刺激IFN-γ的分泌。
 
6.  加入實驗者自己的刺激物（配制成10×終濃度，10μL/well）到實驗孔。加完刺激物之后不要再拍擊ELISPOT板。
 
7.當加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入二氧化碳培養箱，37°C培養18-24小時。
 
三、培養后操作 
 
1.  傾倒孔內的細胞及培養基。
 
2.低滲法將細胞裂解，每孔加入200 μL冰冷的去離子水，將板置于冰上冰浴10分鐘。
 
3.每孔用200 μLPBST洗滌10遍，洗滌zui后一遍之后，將板倒扣在吸水紙上拍干。
 
4.按照試劑盒說明的濃度，用抗體稀釋液稀釋檢測抗體，每孔加入100 μL生物素標記的檢測抗體，37°C1小時。
 
5.  每孔用200 μL PBST洗滌5遍，洗滌zui后一遍時，將PVDF膜板的背面的塑料保護層取下，同時洗滌膜的正反兩面，蓋上保護層，將板倒扣在吸水紙上拍干。
 
6.  按照試劑盒說明的濃度，用抗體稀釋液稀釋酶標的鏈霉親和素，每孔加入100 μL，37°C1小時。
 
7.  每孔用200 μLPBST洗滌5遍，洗滌zui后一遍時，將PVDF膜板的背面的塑料保護層取下，同時洗滌膜的正反兩面，蓋上保護層，將板倒扣在吸水紙上拍干。
 
8.  照試劑盒的說明，解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100 μL的顯色液，室溫靜置20-30分鐘，注意避光。
 
9.  待斑點生長到適合的大小之后，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過程。將板倒扣在吸水紙上，拍干細小的水珠，之后取下保護層，放在通風的地方，室溫靜置10-30分鐘，讓膜自然晾干。注意不要將板放到烤箱內，防止膜發脆、破裂。
 
10.  將ELISPPOT板置于ELISPOT自動讀數儀內，調節好合適的參數，半點計數，并記錄斑點的各種參數，作統計分析。
 
煙酰胺核苷酸轉氫酶抗體注意事項    
一、ELISPOT包被 
 
1.  未潤濕的PVDF膜是潔白的、不透明的，經過乙醇潤濕之后，顏色變暗，變成半透明狀，很容易觀察二者的區別。
 
2.  加乙醇的時候，槍頭應該靠在孔壁接近孔底的地方，注意槍頭不到刺到PVDF膜。
 
3. 有時候，加入的乙醇掛在孔壁上，這時要蓋上板蓋，輕輕叩擊，讓乙醇順勢滑落。乙醇一旦接觸到PVDF膜，就會在表面張力和毛細作用之下迅速浸潤整塊膜，使得膜的顏色和透明度發生變化。
 
4.15 μL是經過優化的體積，它能保證剛好*浸潤整塊膜，而不會有剩余。如果加大使用量，乙醇溶液就會透過膜而積存在膜的背面，加深實驗的背景。
 
二、鋪細胞，加入刺激物，培養 
 
當加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入二氧化碳培養箱，37°C培養18-24小時。注意在整個培養過程中避免移動、碰撞培養板。為了取得更好的結果，甚至開關培養箱的箱門也應該禁止。因為碰撞會造成細胞的移位，造成斑點的模糊、拖尾。
 
三、培養后操作 
 
洗滌膜的背面，在一個淺托盤中盛上干凈的PBST，將膜板的底面浸入，輕輕搖晃幾次即可。注意，一定要將膜的背面和塑料保護層上的液體甩干之后，再合攏，蓋上，不要傷害到膜。