總抗氧能力（T-AOC）測定試劑盒

適用范圍

   本試劑盒適用于檢測動物血清、組織、植物提取等中的總抗氧化能力測定。

一、測定意義

機(jī)體防御體系的抗氧化能力的強(qiáng)弱與健康程度存在著密切，該防御體系有酶促與非酶促兩個體系，許多酶是以微量元素為活性中心，例如：超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）等，非酶促反應(yīng)體系中主要為維生素、氨基酸和金屬蛋白質(zhì)。例如：VE、胡蘿卜素、VC、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、組胺酸、葡萄糖、銅蘭蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白等。這個體系的防護(hù)氧化作用主要通過三條途徑：（1）消除自由基和活性氧以免引發(fā)脂質(zhì)過氧化；（2）分解過氧化物，阻斷過氧化鏈；（3）除去起催化作用的金屬離子。防御體系各成分之間相互起到了協(xié)同作用，以及代償作用與依賴作用。

二、測定原理：

機(jī)體中有許多抗氧化物質(zhì)，能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，通過比色可測出其抗氧化能力的高低。

三、所需儀器設(shè)備

721或722分光光度計(jì)、水浴箱

四、試劑盒組成與配制：（100T/50樣）

1.試劑一：液體60ml×2瓶，4℃保存。

2.試劑二：粉劑×2支，用時每支加雙蒸水至120ml，室溫保存。

3.試劑三：黃色儲備液10ml×1瓶，避光冷藏保存。儲備液的稀釋液60ml×1瓶。

試劑三應(yīng)用液的配制：臨用前取儲備液以稀釋液稀釋，比例為1:19.需多少配多少。

4試劑四:溶液24ml×1瓶，室溫保存。

5.試劑五：溶液24ml×1瓶，室溫保存（天冷時會凝固，每次測試前適當(dāng)加溫以加速溶解，直至透明方可使用）。

五、試劑盒組成與配制：（50T/25樣）

1.試劑一：液體60ml×1瓶，4℃保存。

2.試劑二：粉劑×1支，用時每支加雙蒸水至120ml，室溫保存。

3.試劑三：黃色儲備液5ml×1瓶，避光冷藏保存。儲備液的稀釋液30ml×1瓶。

試劑三應(yīng)用液的配制：臨用前取儲備液以稀釋液稀釋，比例為1:19.需多少配多少。

4試劑四:溶液12ml×1瓶，室溫保存。

5.試劑五：溶液12ml×1瓶，室溫保存（天冷時會凝固，每次測試前適當(dāng)加溫以加速溶解，直至透明方可使用）。

六、操作

（一）   血清（漿）中抗氧化能力測定（樣本前處理見附錄中的*點(diǎn)）

1.  操作表：

漩渦混勻器充分混勻，37℃水浴30分鐘

漩渦混勻器充分混勻，放置10分鐘，蒸餾水調(diào)零，1cm光徑，520nm處測各管吸光度。

*參考取樣量：血清(漿)為0.1ml。

2.計(jì)算公式

總抗氧能力（單位/毫升血清）=（測定管OD值-對照管OD值）/0.01÷30×（反應(yīng)液總體積ml/取樣量ml）×樣品測試前稀釋倍數(shù)

（二）   組織中總抗氧能力的測定（樣本前處理見附錄中的第二點(diǎn)）

1.  操作表

漩渦混勻器充分混勻，37℃水浴30分鐘

漩渦混勻器充分混勻，放置10分鐘，蒸餾水調(diào)零，1cm光徑，520nm處測各管吸光度。

*組織勻漿參考取樣量：為0.1-0.2ml。

2.計(jì)算公式

總抗氧能力（單位/毫克蛋白）=（測定管OD值-對照管OD值）/0.01÷30×（反應(yīng)液總體積ml/取樣量ml）×樣品測試前稀釋倍數(shù)÷所測樣本的蛋白含量

（三）   全血中總抗氧能力的測定：（樣本前處理見附錄中的第五點(diǎn)

1.  操作步驟:

漩渦混勻器充分混勻，37℃水浴30分鐘

漩渦混勻器充分混勻，放置10分鐘，蒸餾水調(diào)零，1cm光徑，520nm處測各管吸光度。

*參考取樣量：全血一般用雙蒸水1：9稀釋取0.05ml。

2.計(jì)算公式：

總抗氧能力（單位/毫升全血）=（測定管OD值-對照管OD值）/0.01÷30×（反應(yīng)液總體積ml/取樣量ml）×樣品測試前稀釋倍數(shù)

七、簡便操作（如果您的樣本很多可以采用簡便操作法）

1.     混合劑的配制：測試前，將試劑一、二、三每種試劑所用量乘以樣本數(shù)（n）再乘以2（因每只測定管均需做對照管），然后再加上放寬的4只，即n×2+4,混合試劑的具體配制見下：

試劑名稱          試劑一              試劑二           試劑三

試劑用量ml     （n×2+4）×1        （n×2+4）×2   （n×2+4）×0.5

將上面所有試劑按順序加在一起混勻制成混合試劑。混合試劑需現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.     血清（漿）、全血簡便操作表：

漩渦混勻器充分混勻，37℃水浴30分鐘。

漩渦混勻器充分混勻，放置10分鐘，雙蒸水調(diào)零，1cm光徑，520nm處，測各管吸光度。

3.     組織樣本簡便操作：

漩渦混勻器充分混勻，37℃水浴30分鐘

漩渦混勻器充分混勻，放置10分鐘，雙蒸水調(diào)零，1cm光徑，520nm處，測各管吸光度。

八、注意點(diǎn)

1.     樣品保存時間：4-8℃保存5-7天，如果暫時不測，超過5天以上可將樣本放在-20℃以下保存，溫度越低保存時間越長。

2.     垂直加樣及加試劑，不要加到管壁上。

3.     可以先加樣品后加1號試劑，但混勻要充分。

4.     若為微量樣品，如耳膜組織、牙髓等進(jìn)行測試時，試管一定要用肥皂水煮開刷洗干凈。

5.     做總抗氧化能力、總氨基酸、維生素C、維生素E的試管應(yīng)與其他品種例如SOD、GSH-PX、ATPase等測試的試管分開，否則會影響酶類的活力。

6.     測定總抗氧化能力、總氨基酸、維生素C、維生素E等的試管清洗時注意：要用熱水加洗滌凈煮開后，剩熱清洗并用自來水沖十余次，單蒸水沖一遍，烤干或晾干。否則會影響其它酶類的測試結(jié)果。

7.     在檢測過程中，37℃水浴30分鐘，在管子中會出現(xiàn)沉淀，加完試劑四后這沉淀會消失，并且不會影響檢測結(jié)果。

8.     在混勻時，用漩渦混勻器，使液體上下充分混勻（一定使zui下面液體也能旋轉(zhuǎn)到上面）。

9.     試劑四難吸難打，注意：在吸取試劑四及加試劑四時要慢慢吸打。

10.  本試劑盒僅用于科研。

T-AOC測定附錄

樣本前處理

1.     血漿樣本前處理：

血漿在測試前3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清待測，否則有 些抗凝劑會引起沉淀及混濁，肝素抗凝的血漿不要離心，血清不需要離心。

2.     組織樣本的前處理:

組織勻漿的制備：準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量體積比加9倍生理鹽水制成10%的勻漿，2000-2500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清待測。同時用雙縮脲試劑測定10%組織勻漿蛋白。

3.     培養(yǎng)細(xì)胞的前處理:

培養(yǎng)細(xì)胞懸液的制備：

將培養(yǎng)細(xì)胞消化，離心，棄上清，留下層細(xì)胞，用生理鹽水或勻漿介質(zhì)制備成107/cm3的懸液，即107/ml的懸液，再進(jìn)行破碎。破碎細(xì)胞的方法有三種;1.用云將器勻漿。（可以用勻漿機(jī)，也可以用玻璃勻漿器手工勻漿）。2.用進(jìn)口的超聲粉碎器粉碎。3.反復(fù)凍融3次。（第3種方法有時會影響酶活力。）制備號的細(xì)胞懸液不需要離心，在測試家樣前要搖勻后取樣。同時用考馬斯亮蘭試劑測定組織蛋白。

4.     培養(yǎng)細(xì)胞的上清及部分體液均可以按照血清樣本處理，一般直接加樣。

5.     全血樣本前處理，一般用雙蒸水10倍稀釋，具體稀釋倍數(shù)及取樣量要做預(yù)試。