關(guān)于血球計(jì)數(shù)板的使用及問題討論

一、血球計(jì)數(shù)板的使用原理

顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱計(jì)菌器），于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，然后推算出含菌數(shù)的一種方法。血球計(jì)數(shù)板是常用的計(jì)菌器之一。

血球計(jì)數(shù)板是一種專門用于計(jì)算較大單細(xì)胞微生物的一種儀器，由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四條下凹的槽，構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊上面刻有一個(gè)方格網(wǎng)。方格網(wǎng)上刻有9個(gè)大方格，其中只有中間的一個(gè)大方格為計(jì)數(shù)室。這一大方格的長和寬各為1mm，深度為0.1mm,其容積為0.1mm³，即1mm×1mm×0.1mm方格的計(jì)數(shù)板；大方格的長和寬各2mm,深度為0.1mm,其容積為0.4mm³，即2mm×2mm×0.1mm方格的計(jì)數(shù)板。在血球計(jì)數(shù)板上，刻有一些符號(hào)和數(shù)字，其含義是：XB-K-25為計(jì)數(shù)板的型號(hào)和規(guī)格，表示此計(jì)數(shù)板分25個(gè)中格；0.1mm為蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室的高；1/400mm²表示計(jì)數(shù)室面積是1mm²，分400個(gè)小格，每小格面積是1/400 mm²。

計(jì)數(shù)室通常也有兩種規(guī)格：一種是16×25型，即大方格內(nèi)分為16中格，每一中格又分為25小格；另一種是25×16型，即大方格內(nèi)分為25中格，每一中格又分為16小格。但是不管計(jì)數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即每一大方格都是16×25=25×16=400個(gè)小方格組成。

1．16×25型的計(jì)數(shù)板  將計(jì)數(shù)室放大，可見它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四個(gè)中方格（100個(gè)小方格）計(jì)數(shù)。將每一中格放大，可見25個(gè)小格。計(jì)數(shù)重復(fù)3次，取其平均值。計(jì)數(shù)完畢后，依下列公式計(jì)算：

酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)／1mL=100個(gè)小方格細(xì)胞總數(shù)/100 ×400×10000×稀釋倍數(shù)

2．25×16型的計(jì)數(shù)板  中央大方格以雙線等分成25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格，供細(xì)胞計(jì)數(shù)用。一般計(jì)數(shù)四個(gè)角和中央的五個(gè)中方格（80個(gè)小方格）的細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)重復(fù)3次，取其平均值。計(jì)數(shù)完畢后，依下列公式計(jì)算：

酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)／1mL ＝80個(gè)小方格細(xì)胞總數(shù)/80 ×400×10000×稀釋倍數(shù)

血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造（三）（25×16）

a．頂面觀  b．側(cè)面觀  c．放大后的網(wǎng)格  d．放大后的計(jì)數(shù)室

二、血球計(jì)數(shù)板的使用方法步驟

1．鏡檢計(jì)數(shù)室。在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2．加樣品。將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室上加蓋的蓋玻片，用吸管吸取稀釋后的酵母菌懸液，滴于蓋玻片邊緣，讓培養(yǎng)液自行緩緩滲入，一次性充滿計(jì)數(shù)室，防止產(chǎn)生氣泡，充入細(xì)胞懸液的量以不超過計(jì)數(shù)室臺(tái)面與蓋玻片之間的矩形邊緣為宜。多余培養(yǎng)液可用濾紙吸去。

3．計(jì)數(shù)。稍待片刻（約5min），待酵母菌細(xì)胞全部沉降到計(jì)數(shù)室底部后，將計(jì)數(shù)板放在載物臺(tái)的中央，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)室所在位置后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察、計(jì)數(shù)并記錄。

三、血球計(jì)數(shù)板的使用注意事項(xiàng)

《培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化》實(shí)驗(yàn)是一個(gè)歷時(shí)較長（7天左右）的實(shí)驗(yàn)，事前一定要做好周密的計(jì)劃，定程序、定時(shí)間、定人員。每天采用抽樣檢測(cè)法使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，在計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)從以下幾方面注意：

1．每天同一時(shí)間，各組取出本組的試管，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)酵母菌個(gè)數(shù)，并作記錄，連續(xù)觀察7天。

2．從試管中吸出培養(yǎng)液進(jìn)行計(jì)數(shù)之前，要將試管輕輕震蕩幾下，這樣使酵母菌分布均勻，防止酵母凝聚沉淀，提高計(jì)數(shù)的代表性和準(zhǔn)確性，求得的培養(yǎng)液中的酵母菌數(shù)量誤差小。

3．如果一個(gè)小方格內(nèi)酵母菌過多，難以數(shù)清，應(yīng)當(dāng)對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋以便于酵母菌的計(jì)數(shù)。具體方法是：搖勻試管，取1mL酵母菌培養(yǎng)液，加入成倍的無菌水稀釋，稀釋n倍后，再用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，所得數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)。以每小方格內(nèi)含有4—5個(gè)酵母細(xì)胞為宜。特別是在培養(yǎng)后期的樣液需要稀釋后計(jì)數(shù)。

4．活酵母有芽殖現(xiàn)象，若芽體達(dá)到母細(xì)胞大小的一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)，若芽體小于母細(xì)胞一半時(shí)為1個(gè)酵母細(xì)胞。

5．對(duì)于壓在方格界線上的酵母菌應(yīng)當(dāng)計(jì)數(shù)同側(cè)相鄰兩邊上的菌體數(shù)，一般可采取“數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線”的原則處理，另兩邊不計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，如果使用16格×25格規(guī)格的計(jì)數(shù)室，要按對(duì)角線位，取左上、右上、左下、右下4個(gè)中格(即100個(gè)小格)的酵母菌數(shù)；如果規(guī)格為25格×16格的計(jì)數(shù)板，除了取其4個(gè)對(duì)角方位外，還需再數(shù)中央的一個(gè)中格(即80個(gè)小方格)的酵母菌數(shù)。

6．計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來計(jì)算，對(duì)每個(gè)樣品可計(jì)數(shù)三次，再取其平均值。計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)不時(shí)調(diào)節(jié)焦距，才能觀察到不同深度的菌體。按公式計(jì)算每1ml（或10mL）菌液中所含的酵母菌個(gè)數(shù)。

7．血球計(jì)數(shù)板的清潔

血球計(jì)數(shù)板使用后，用自來水沖洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，或用95%的乙醇、無水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑脫水使其干燥。通過鏡檢觀察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)清洗直到干凈為止

四、關(guān)于血球計(jì)數(shù)板的命題

由于實(shí)驗(yàn)《培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化》是新教材新增加的實(shí)驗(yàn)，在各地各類命題中都關(guān)注了這一實(shí)驗(yàn)，并對(duì)血球計(jì)數(shù)板的使用進(jìn)行了命題設(shè)計(jì)。從近年來的各類試題來看，試題考查的角度不同，大多數(shù)是關(guān)于細(xì)胞數(shù)量的計(jì)算，也有關(guān)于使用原理和方法的考查，但有的試題明顯與血球計(jì)數(shù)板的實(shí)際使用不相符。

例1 在用血球計(jì)數(shù)板（2mm×2mm方格）對(duì)某一稀釋50倍樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在一個(gè)方格內(nèi)（蓋玻片下的培養(yǎng)液厚度為0.1mm）酵母菌平均數(shù)為16，據(jù)此估算10mL培養(yǎng)液中有酵母菌       個(gè)。　（參考答案： 2×10⁷）

例2 在“探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的變化”實(shí)驗(yàn)中，某同學(xué)用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)血球計(jì)數(shù)板的小方格(2 mm×2 mm)內(nèi)酵母菌數(shù)量的平均值為13個(gè)。假設(shè)蓋玻片下的培養(yǎng)液厚度為0.1 mm，那么10mL培養(yǎng)液中酵母菌的個(gè)數(shù)約為      個(gè)。 （參考答案：Ｂ）

A．5.2×10⁴    B．3.25×10⁵        C．5.2×10³    D.3.25×10⁴

解析一：例1例2兩題，均將整個(gè)計(jì)數(shù)室2mm×2mm方格作為實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)的空間，并按照公式：a/4×10⁵（×稀釋倍數(shù)）來計(jì)算10mL培養(yǎng)液中的酵母菌的數(shù)量（a為所計(jì)數(shù)酵母菌的平均數(shù)）。與血球計(jì)數(shù)板的實(shí)際操作不相符，特別是例2中將2mm×2mm的計(jì)數(shù)室當(dāng)成一個(gè)小方格了，存在有科學(xué)性錯(cuò)誤。  

例3 通常用血球計(jì)數(shù)板對(duì)培養(yǎng)液中酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，若計(jì)數(shù)室為1mm×1mm×0.1mm方格，由400個(gè)小方格組成，如果一個(gè)小方格內(nèi)酵母菌過多，難以計(jì)數(shù)，應(yīng)先　　后再計(jì)數(shù)。若多次重復(fù)計(jì)數(shù)后，算得每個(gè)小方格中平均有5個(gè)酵母菌，則10mL該培養(yǎng)液中酵母菌總數(shù)有　　　　個(gè)。（參考答案：稀釋；2×10⁸）

解析二：例3設(shè)計(jì)了血球計(jì)數(shù)板的規(guī)格，還考查了血球計(jì)數(shù)板的使用方法，較例1例2更科學(xué)合理。根據(jù)公式：5×400×10000×10＝2×10⁸。

例4  檢測(cè)員將1 mL水樣稀釋10倍后，用抽樣檢測(cè)的方法檢測(cè)每毫升藍(lán)藻的數(shù)量；將蓋玻片放在計(jì)數(shù)室上，用吸管吸取少許培養(yǎng)液使其自行滲入計(jì)數(shù)室，并用濾紙吸去多余液體。已知每個(gè)計(jì)數(shù)室由25×16＝400個(gè)小格組成，容納液體的總體積為0．1 mm³。

解析三：從例4來看，是按照血球計(jì)數(shù)板的原理進(jìn)行設(shè)計(jì)試題的，還添加了相應(yīng)的圖示，題意一目了然。按照前面所述的公式，不難得出正確答案：酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)／1mL＝80個(gè)小方格細(xì)胞總數(shù)/ 80 ×400×10000×稀釋倍數(shù)＝n/ 80×400×10000×10＝5n×10⁵