多西他賽與吉非替尼對人肺癌細胞的作用

　　多西他賽和吉非替尼均是晚期非小細胞肺癌( non-small cell lung cancer,  NSCLC)的一線和二線治療藥物，日前兩者療效都達平臺期。除尋找新的靶向治療靶點外，如何進一步提高化療和表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑(EG FR-TKIs)的療效是晚期NSCLC面臨的問題?；熕幬锱cEGFR-TKIs作用的機制不同，理論上兩者同時應用可能有增效作用。細胞學研究顯示，EG FR-TKIs聯合化療藥物能明顯增強對NSCLC細胞生長的抑制作用，起到“1+1>2”的作用川。但是，多項大型臨床研究INTACTl }2} ,INTACT2}3}、TRIBUTE}4}和TALENTS均顯示EGFR-TKIs與化療同時作用在有效率及生存期方面并未優于單獨化療，且無疾病進展時間和疾病控制率未能提高。上述結果引發了兩個問題:(1)對于EGFR-TKIs與化療同時使用是否一也存“優勢人群”‘了例如TRIBUTE研究中EGFR突變患者采用化療聯合厄洛替尼的有效率顯著高于野生型( 53 % vs. 18 % , P = 0. 012 ) }  ( 2 ) EGFR-TI}I與化療序貫應用是否具增效作用，序貫應用增效作用是否也存在“優勢人群”‘了日本的WJTOG0203 III期臨床試驗證實，先化療后序貫吉非替尼能夠提高肺腺癌患者的總生存時間[6es。說明化療聯合EGFR-TKIs的增效作用不僅與用藥順序有關，還可能與NSCLC細胞EGFR突變狀況有關。因此，本研究的*個日的是通過觀察多西他賽和吉非替尼不同順序用藥對EGFR野生型和EGFR突變型細胞生長的影響，尋找NSCLC細胞不同EGFR突變狀況的*給藥方式。

　　化療與EG FR-TKIs二者聯合應用增效與否的細胞學機制不明。既往研究顯示，化療同時應用EGFR-TKIs不增效的原因可能與細胞周期有關[,H }化療后序貫應用EGFR-TKIs產生協同增效作用可能與EGFR磷酸化有關[91。近年的研究表明胰島素

　　樣生長因子受體1( IGF-1 R)亦可通過細胞內信號蛋自PI3 K/AKT影響細胞對化療及EG FR-TKIs敏感性[i o-i i }。因此，本研究的第二個日的旨在通過檢測多西他賽與吉非替尼不同時序應用對EGFR野生型和突變型肺腺癌細胞的EGFR , IGF-1 R、下游信號蛋自表達磷酸化影響及細胞周期變化，尋找可能的細胞學機制。

　　材料與方法

　　1. 1材料人肺腺癌A549細胞由中科院上海細胞生物研究所提供，PC-9細胞由日本國立癌癥中心小泉史明博士惠贈} }z}。四甲基偶氮哩鹽[3- ( 4 , 5-dime-thvlthiazol-2-vl)-2，5-diphenvl-tetrazolium   bromide，MTT、二甲基亞礬( DMSO)購自Sigma公司。吉非替尼和多西他賽分別由阿斯利康制藥有限公司及江蘇恒瑞公司提供，均溶于DMSO中，以5 x 10-3mo1/L-20℃保存。胞外調節蛋自激酶(ERI}1/2)一抗、蛋自激酶B ( AKT)一抗、IGF-1 R一抗、內參((3-actin ) ,磷酸化表皮生長因子受體(p-EG FR)一抗、磷酸化蛋自激酶B ( p-AKT)一抗、磷酸化胰島素樣生長因子受體1( p-IGF-1 R)一抗以及p-ERKl /2均購自Cell Signa-ling公司，表皮生長因子受體(EGFR)一抗購自SantaCruz公司，兔源及鼠源二抗購自Cell Signaling公司，BCA試劑盒購自Pirce公司。ECL化學發光試劑盒購自GE Healthcare公司。DNA提取試劑盒購自天根生物公司。電泳儀及化學發光成像系統購自Bio-Rad公司，酶聯免疫檢測儀購自Bioce112010公司。流式細胞檢測盒購自碧云天公司，流式細胞儀購自BeckmanCoulter公司。1. 2細胞培養人肺腺癌細胞A549和PC-9置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 ( Gibc。公司)培養

　　液，370a ,5% a02培養箱中培養，細胞單層貼壁生長。實驗取用生長狀態良好的對數生長期細胞，胰酶消化傳代，收集備用。

　　1. 3  A549 ,Pa-9細胞的EGFR和K-Ras基因突變檢測將處于對數生長期的細胞，胰酶消化，離心重懸后按基因組DNA提取試劑(TIANGEN)說明操作提取DNA。分別取A549,Pa-9細胞DNA產物8閃進行電泳，1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。細胞EGFR及K-Ras突變檢測送蘇州為真生物醫藥有限公司，采用高分辨率溶解曲線分析技術(quantitativePCR high-resolution melting,qPCR-HRM)完成。

　　1. 4四甲基偶氮哇鹽( MTT)法檢測藥物對A549,Pa -9細胞生長作用影響取對數生長的細胞，接種至96孔培養板，A549 100()個細胞，Pa-9 200()個。每組4個平行復孔，細胞貼壁后，再按實驗要求分別加人100閃含有不同濃度的多西他賽或吉非替尼的培養基，按實驗設計時間換含有不同藥物的培養基。每孔加MTT 20},1(Sg/L)，孵育4h后棄上清，加人150,1 DMSO，振蕩15 min后酶標儀測定492 nm波長下各孔吸光值(A)，計算細胞抑制率和半數抑制濃度(IaSO}。實驗分組:PBS對照組(a}、多西他賽單獨作用72h組(D)、吉非替尼單獨作用72h組( G) ,多西他賽作用24h序貫吉非替尼48h組( DG)、吉非替尼作用48h序貫多西他賽作用24h組(GD)和同時給藥72h組(D+G)，實驗重復3次。抑制率=100%一(用藥組A值一空自對照A值)/(陰性對照組A值一空自對照A值)。

　　1. 5   Western hlottin。檢測細胞信號蛋白細胞按上述分組給藥處理后，將原培養基連同胰酶消化下的細胞離心，冷PBS洗滌3次，加人含有蛋自酶抑制劑和磷酸化蛋自酶抑制劑的裂解液，冰上提取蛋自，BCA法測定蛋自濃度，等量上樣，10%  SDS-PAGE電泳，轉膜，5%牛血清自蛋自封閉2h，一抗(1:40()一1000 ) 4 0C搖床孵育置夜，TBST洗膜lOmin x3次，二抗(1 : 2000)室溫搖床孵育1h, TBST洗膜l Omin x 3次，ECL顯色后化學發光成像系統成像。

　　以Band Scan圖像分析軟件進行A值分析。

　　1. 6流式細胞術檢測細胞周期變化取生長狀態良好的對數生長期A549細胞及PC-9細胞接種于30cm2的培養皿中。A549接種1 x 10}個，PC -9接種2x10個。按上述分組給藥，消化，收集細胞，制成單細胞懸液，用碧云天流式細胞試劑盒提取和DNA染色，流式細胞儀測細胞周期，Ce11Fit軟件進行細胞周期分布的測定;實驗重復3次。

　　1.7統計學分析采用SPSS 13. 0軟件分析，數據用均數士標準差表示，多組間計量資料用單因素方差分析。以P < 0. OS為差異具有統計學意義。

　　2結果

　　2. 1肺腺癌細胞EGFR和K-Ras基因表達采用qPCR-HRM對人肺腺癌A549 , PC-9細胞的EGFR基因18,19,20,21外顯子和K-Ras基因2 ,3外顯子進行突變檢測。結果顯示，A549細胞的EGFR基因無突變，K-Ras基因第2外顯子突變。PC-9細胞的EGFR基因第19外顯子突變，K-Ras基因無突變。

　　2. 2多西他賽與吉非替尼對肺腺癌細胞生長的影響正常培養的兩株肺腺癌細胞生長均呈無限繁殖，A549細胞第2天進人對數生長期，PC-9細胞第3天進人對數生長期。多西他賽和吉非替尼單藥或聯合用藥均能抑制A549和PC-9細胞生長，呈濃度依賴性。多西他賽和吉非替尼作用72h抑制A549細胞生長的ICS〕分)I為5. 24 x 10 -' mol/L和1. 28 x 10-5mo1/L(P <0. OS)，抑制PC-9細胞生長的ICS〕分別為2. 13x 1()一“mol/L和4. 58 x 1()一“mol/L。見圖

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　　圖1不同濃度吉非替尼和多西他賽對A549和PC-9細胞生長的影響分別取多西他賽和吉非替尼的ICSc〕作為固定濃度，按上述分組方法研究不同給藥方式下兩藥對A549和PC -9細胞的抑制作用。結果顯示，相比D,G組，DG組對A549和PC -9細胞的生長抑制作用均明顯增強(P <0.05)，抑制率分別為60. 0%和57.45%} (D+G)組只對EGFR突變型的PC -9細胞的生長抑制有增效作用，抑制率為53. 46%，較單藥組明顯增高(P <0.05);在EGFR野生型的A549細胞中，(D+G)組的抑制率為48. 25 %，與D,G組無明顯差異。而GD組對A549和PC-9細胞的抑制率均無明顯的協同增效作用，抑制率分別為46. 46%和46. 59 0}o。。見表1。)

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　　2. 3多西他賽與吉非替尼不同時序應用對細胞EGFR,ERK,AKT, IGF-1 R表達及其磷酸化的影響單藥多西他賽增強A549和PC-9細胞EGFR和ERK磷酸化，單藥吉非替尼抑制A549和PC-9細胞EGFR和ERK磷酸化，多西他賽誘導EGFR和ERK磷酸化被序貫應用吉非替尼顯著抑制，但不能被同時應用吉非替尼抑制。吉非替尼抑制EGFR和ERK磷酸化作用不能被應用多西他賽逆轉。多西他賽與吉非替尼不同時序應用對A549和PC -9細胞的AKT及其磷酸化均無明顯影響。單藥多西他賽抑制A549細胞IG F-1 R表達及其磷酸化，單藥吉非替尼增強A549細胞IG F-1 R表達及其磷酸化。兩藥聯合對PC-9細胞的IG F-1 R表達無影響，但均抑制IG F-1 R磷酸化。兩藥同時應用對抑制PC-9的細胞IGF-1 R磷酸化具增強作用，對A549細胞IGF-1R磷酸化無明顯影響。見圖2}

　　2. 4多西他賽與吉非替尼不同應用對細胞周期的影響對于A549細胞，G組未引起明顯的細胞周期變化，D組可引起明顯的G}期阻滯，由C組的6. 63%上升為49.58%(P<0.05)} DG組有明顯的

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　　圖2吉非替尼和多西他賽同時及序貫應用對A549和PC-9細胞信號蛋白表達的影響GZ期阻滯，較C組上升約54.11%(P<0.05)}  (D+G)組和GD組各期細胞無明顯變化。對于PC -9細胞，G組可引起明顯的G},/G，期阻滯，G},/G，期細胞較C組上升29.96%  (P <0. OS) } D組可引起明顯的GZ期阻滯，較C組上升30.13%  (P<0.05)}DG組可見明顯的G:期阻滯，較C組上升40. 77 %(P<0.05)}  (D+G)組和GD組與C組相比，細胞周期變化不明顯，味/G，期細胞比例提高13. 27%和17. 10%。見圖3 }

　　3討論

　　本研究結果顯示，人肺腺癌細胞A549細胞為EGFR野生型，K-Ras基因突變型;PC-9細胞為EG-FR突變型，K-Ras基因野生型。細胞生長實驗顯示A549和PC-9細胞分別為吉非替尼耐藥型和敏感型，其ICSc〕分)I為1. 28 x 1()一5 mol/L和4. 58 X 1()一smol/L，對吉非替尼的敏感性相差1000倍，結果與既往報道的一致[‘3141。基于臨床研究顯示化療與EG-FR-TKIs同時或序貫應用可能存在“優勢人群”，而這種“優勢人群”可能源于EGFR突變狀況，我們同時選用EGFR野生型的A549細胞和EGFR突變型

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　　的PC-9細胞進行研究并從細胞信號傳導蛋自和細胞周期對其可能的細胞學機制進行探討。

　　Cappuzzo等} ISO報道的SATURN研究發現化療聯合EGFR-TKI增效作用與用藥順序相關，先化療再序貫EGFR-TKI能夠提高有效率，延長無疾病進展期及肺腺癌患者總生存。本研究結果發現，不論是EGFR野生型的A549細胞還是EGFR突變型的PC -9細胞，多西他賽序貫吉非替尼對這兩株人肺腺癌細胞生長的抑制作用都較單藥多西他賽明顯增強，兩株細胞間無明顯差別，結果說明EGFR突變不

　　是化療后序貫EGFR-TKI優勢受益人群，與既往的研究一致。(Ciovannetti等[‘6es在細胞學實驗基礎上探討化療藥物與吉非替尼以不同順序作用于肺癌細胞的結果發現，不論肺癌細胞是否存在EGFR突變，應用化療藥物后，只有細胞EGFR磷酸化(pEG-FR)水平增加者才能從后續的吉非替尼治療中獲益，而與EGFR是否存在突變或擴增無關。新近的INFORM研究亦發現化療后吉非替尼維持治療晚期NSCLC患者EGFR突變者無進展生存期(PFS)的獲益zui大[‘7es。Mok等psl報道在非選擇人群中比較吉西他濱聯合鉑類+厄洛替尼與單純吉西他濱聯合鉑類化療療效的11期研究(FAST-ACT，發現化療序貫EGFR-TKI能顯著延長PFS(29.4周。.23. 4周，P = 0. 002。是否延長總生存日前正在進行一項111期臨床試驗( FAST-ACT II)加以證實。

　　本研究兩藥同時應用僅對EGFR突變型的PC-9細胞生長抑制有增效作用，對EGFR野生型的A549細胞無增效作用，與既往的研究結果一致[9，‘6es。雖然有研究顯示化療與EGFR-TKI同時應用，其增效與否與EGFR突變狀況有關，但日前臨床研究的結果尚存爭議。TRIBUTE研究對患者組織學標本進行EGFR 18一21和K-Ras基因進行突變

　　檢測，結果提示，EGFR突變的患者化療聯合厄洛替尼有效率顯著高于野生型(53 %  vs. 18 % , P =0. 012，但缺少與單藥厄洛替尼的對比。INTACT試驗對比了EGFR突變型與野生型患者聯合應用化療和吉非替尼的療效，結果顯示不論在有效率還是總生存方面，兩組患者均無明顯差異，因此認為僅憑EGFR突變與否預測化療聯合EGFR-TKI同時治療的有效率是不夠的[23es。

　　EGFR-TKI通過競爭性與EGFR結合，阻斷其酪氨酸的自身磷酸化及酪氨酸激酶活化，主要通過抑制PI3 K-AKT和MARK/ERK信號傳導，實現抑制腫瘤細胞生長、加速細胞凋亡、抑制血管生成和抑制浸潤與轉移。化療聯合EGFR-TKIs增效與否的細胞學機制不明，既往研究顯示化療同時應用EGFR-TKIs不增效的發生機制可能與細胞周期有關[,H }化療后序貫應用EGFR-TKIs產生協同增效作用可能與EGFR磷酸化有關[‘6es。

　　本研究發現，不論A549細胞還是PC-9細胞，多西他賽增強EGFR和ERK磷酸化，而吉非替尼呈抑制作用。先用多西他賽后序貫吉非替尼的EGFR和ERK磷酸化水平明顯較多西他賽與吉非替尼同時應用或單獨應用多西他賽降低，這種EGFR和ERK磷酸化水平的變化不伴有EGFR和ERK的增加，這一結果與我們先前在另一EGFR野生型的SPC-1 A細胞發現的一致[‘ges，說明化療上調EGFR和 ERK磷酸化，使吉非替尼抑制EGFR及ERK敏感性增強，這是化療序貫吉非替尼的協同增效作用的細胞學機制之一。Van Schaeybroeck}20}和Giovan-netti} }}}報道，化療與EGFR-TKI聯合應用于不同的NSCLC細胞，只有細胞EGFR磷酸化(p-EGFR)水平增加者才能從后續的吉非替尼治療中獲益，而與EGFR是否存在突變或擴增無關。此外，細胞周期

　　顯示，多西他賽將兩株細胞阻滯在Gz期，已知細胞在Gz/M期開始DNA損傷的修復和分裂。因此，多西他賽序貫吉非替尼組使Gz/M期細胞顯著增多，無法從影響細胞周期來解釋這一協同作用現象，結果與既往的研究一致[} 14-I S }v

　　同時應用多西他賽與吉非替尼對EGFR野生型的A549細胞無增效作用。吉非替尼抑制A549細胞EGFR和ERK磷酸化不能被同時應用的多西他賽逆轉，這一結果與我們先前在另一EGFR野生型的人肺腺癌SPC-A1細胞結果一致[191，說明多西他賽未增強吉非替尼抑制細胞生長作用可能與EGFR和ERK磷酸化水平低下有關。Van Schaeybroeck等}zo}報道在結直腸癌細胞中，下調EGFR磷酸化水平能導致EG FR-TKI與細胞毒化療藥物產生拮抗作用。

　　同時應用多西他賽與吉非替尼對EGFR突變型的PC-9細胞生長抑制有增效作用。吉非替尼抑制PC -9細胞EGFR和ERK磷酸化亦不能被同時應用的多西他賽逆轉，因此，EGFR和ERK磷酸化不是其增效機制。既往研究顯示，IGF-1 R表達與細胞對化療及EG FR-TKI、敏感性相關[21-221，干擾細胞IGF-1R表達或IGF-1 R抑制劑可以提高NSCLC細胞對化療藥物及EG FR-TKIs的敏感性，化療藥物如多西他賽誘導腫瘤細胞凋亡機制亦包括了對IGF-1 R的抑制，增加化療藥物敏感性與抑制PI3 K/AKT關系密切[lol。反之，EG FR-TKI、影響IGF-1 R表達[zz }本研究兩株肺腺癌細胞均表達IGF-1 R,多西他賽與吉非替尼均抑制PC-9細胞IGF-1 R磷酸化表達。與單藥多西他賽或吉非替尼比，兩藥同時應用對PC -9的細胞IGF-1 R磷酸化抑制有增強作用，但對A549細胞IGF-1 R磷酸化無明顯影響。結果提示同時用藥對EGFR突變的PC -9細胞有增效作用，可能與其增強對IGF-1 R磷酸化抑制作用有關，日前我們正進行上調或沉默IG F-1 R觀察同時用藥對EGFR突變的PC-9細胞是否具增效作用加以證實。

　　本研究應用吉非替尼序貫多西他賽對抑制A549細胞和PC -9細胞生長，均未產生增效作用，鑒于吉非替尼抑制EGFR和ERK磷酸化作用亦不能被序貫應用的多西他賽逆轉，用EGFR和ERK磷酸化變化無法解釋這一現象。細胞周期結果顯示，吉

　　非替尼序貫多西他賽使GZ/M期細胞顯著減少，而G},/G，期細胞顯著增多，細胞周期阻斷在G},/G, ,即進人生長增殖期(S , Gz/M期)的細胞數量明顯減

　　少，減弱了多西他賽的細胞毒作用，所以當吉非替尼序貫多西他賽或者與多西他賽同時作用時，二者無增效作用，這一結果可以用細胞周期變化來解釋，與既往的報道一致[7A}v

　　多西他賽與吉非替尼不同時序應用對A549和PC一細胞AKT及其磷酸化均無明顯影響，說明E G-FR受體細胞內信號蛋自AKT及其磷酸化不是化療聯合EGFR-TKIs對NSCLC細胞生長影響的細胞學機制。

本研究的初步結果顯示，多西他賽與吉非替尼同時應用只對EGFR突變型的PC -9細胞具增效作用，但多西他賽序貫吉非替尼的增效作用與EGFR突變狀況無關。值得注意的是，本研究僅觀察了一種EGFR突變型細胞，有待在不同EGFR突變型NSCLC細胞加以證實，EGFR突變是否可以作為化療聯合EGFR-TKI的優勢受益人群，尚需前瞻性的多中心隨機對照試驗加以證實。)