干細胞分選技術(shù)

干細胞是一類具有自我復(fù)制和分化潛能的細胞，包括胚胎干細胞和成體干細胞。新近研究表明干細胞可以為臨床細胞替代治療和移植治療提供新的細胞來源，有廣闊應(yīng)用前景。

干細胞的分類

根據(jù)干細胞的來源、發(fā)育階段、分化趨勢將它們分為兩大類：ES細胞和成體干細胞（或稱之為特定組織干細胞，如造血干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞等）。

ES細胞：ES細胞是從附置前早期胚胎內(nèi)細胞團或附置后胚胎原始生殖細胞分離克隆的一類具有自我更新能力和發(fā)育性的，并能產(chǎn)生分化后代能力的早期胚胎細胞，包括畸胎瘤干細胞(EC細胞)，ES 細胞,胚胎生殖細胞(EG細胞)。它們的基本特性是具有發(fā)育的性，能分化為屬于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的各種分化細胞，即具有分化成為機體內(nèi)任何一部分組織和器官的能力，因而有人稱之為“”細胞。

成體干細胞：成體干細胞也稱為特定組織干細胞，是指成體組織中所存在的具有自我更新與產(chǎn)生本系統(tǒng)后繼續(xù)分化能力的那類細胞，它們在特定的條件下，可以對稱地分裂為2個新的子代干細胞或2個功能細胞，也可以不對稱地分裂成1個子代干細胞和1個功能干細胞，從而使組織分化成與器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。

干細胞的應(yīng)用
隨著細胞替代治療的發(fā)展，干細胞 移植治療已成為臨床上治療某些疾病的重要手段，利用干細胞在體外擴增培養(yǎng)并誘導(dǎo)成所需要的細胞后移植入患者體內(nèi)，用于組織損傷的修復(fù)、退行性器官的替代及改善遺傳性缺陷組織器官的功能。而成體干細胞可塑性分化的發(fā)現(xiàn)，為細胞替代治療提供了新的種子細胞。
 
干細胞的分離純化
所謂細胞分離（cell isolation）,指的是將組織分散制成細胞懸液后從中獲取目的細胞的過程。而所謂細胞純化更進一步強調(diào)從原代培養(yǎng)前成分混雜的異質(zhì)性細胞懸液中或者從培養(yǎng)物中獲得單一類型細胞的過程。通過細胞的分離和純化過程，使培養(yǎng)物成為單一類型培養(yǎng)物，甚至是遺傳特性*一致的培養(yǎng)物，后者即細胞系。分離和純化兩個概念之間沒有截然的界限，許多情況下，細胞分離和純化并不是**的，培養(yǎng)物中只能達到以某種細胞為主的程度，所以也成稱為富集(enrichment)。 分離和純化細胞的過程不僅僅在原代培養(yǎng)之前進行的，有時分離和純化細胞的過程還貫穿于原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)的過程中，甚至是主要依賴培養(yǎng)過程實現(xiàn)分離和純化細胞的目的。培養(yǎng)物中細胞成分是否單一或者目的細胞在培養(yǎng)物中的比例如何，常是衡量某一培養(yǎng)工作是否成功的重要指標。
 
干細胞的分離純化、密度梯度離心技術(shù)、逆流淘析分離技術(shù)、利用細胞表面標志分離純化細胞的方法等。

密度梯度離心技術(shù)

利用細胞體積和密度進行分離純化的技術(shù)均基于沉降作用。其基本原理是，在離心力的作用下，細胞在一定介質(zhì)中的的沉降速率與細胞的體積及細胞密度和其周圍介質(zhì)的密度之差成正比。細胞的體積越大，其余分離介質(zhì)的密度差越大，則細胞的沉降速率越快。對于特定的待分離細胞來說，其體積和密度是恒定的，可供選擇的只是具有一定密度與黏度的分離介質(zhì)。使之沉降的細胞密度應(yīng)該比介質(zhì)大，而使之漂浮的細胞密度應(yīng)該比介質(zhì)小。因此實施沉降技術(shù)分離細胞的關(guān)鍵在于選擇密度梯度形成介質(zhì)，故稱將技術(shù)也稱為密度梯度離心技術(shù)。

逆流淘析分離技術(shù)是通過含細胞介質(zhì)溶液的流力和福利與細胞所受離心力之間相互作用而分離細胞的一種技術(shù)。細胞置于一特殊的離心室中，離心室成錐形狀，其定點指向沉降方向，細胞懸浮于以向心方向連續(xù)流動的介質(zhì)溶液中，同時受到離心力的作用。當向外的離心力于內(nèi)向的流立即浮力達到平衡時，每個細胞將按照它的的沉降速率達到其平衡位置。通過這一技術(shù)可進一步分離淋巴細胞和單核細胞。

選擇性細胞凝集

纖維素可以使紅細胞形成大的“錢串”，加速其沉降，從而比其他細胞更快地從造血細胞懸液中沉降出去。這一方法通常用于快速去除大量成熟紅細胞，而不會對有核細胞群造成太大的損失。但是，與上面提到的密度梯度離心和逆流淘析步驟一樣，這一方法并沒有使干細胞群相對于有核細胞發(fā)生太多的富集。

基于不同粘附特性的細胞分離方法

粘附于某些固相物質(zhì)如玻璃或塑料的表面，使某些類型細胞的基本生物學(xué)特性之一，但另一些細胞卻缺乏這種能力；或某些細胞的粘附能力強，粘附作用快，而某些細胞的粘附能力弱或粘附作用慢。根據(jù)這些差異，可以分離或消除某些類型的細胞。這種將粘附較快的細胞與粘附較慢的細胞（貨物粘附能力）的細胞分離開來并分別收集的處理過程就稱為差粘附處理。差速粘附處理常用于分離細胞懸液中的成纖維細胞與其它組織細胞。

利用細胞表面標志分離純化細胞的方法

單克隆抗體的特異性和多樣性是利用不同抗體的合理組合分離不同類型的細胞成為可能。目前抗體介導(dǎo)的細胞分離技術(shù)主要有：抗體/補體介導(dǎo)細胞溶解法，流式細胞儀分選法，平面粘附分離法，免疫磁珠分離法等。從抗體介導(dǎo)技術(shù)獲得細胞的家渡看，又可分為陽性細胞分選法和陰性細胞分選法。擬從混雜細胞群體中獲得表達與抗體相應(yīng)膜抗原的細胞群，稱為陽性細胞分選法；反之，擬除去表達與抗體相應(yīng)膜抗原的細胞，而收集其余的細胞群體，稱為陰性細胞分選法。其中上述抗體/補體介導(dǎo)細胞溶解法為陰性細胞分選法，其余3種方法既可以作為陽性細胞分選技術(shù)，也可以作為陰性細胞分選技術(shù)。

免疫溶解法

當補體存在時，用抗細胞某一表面標志的特異性抗體與異質(zhì)性細胞一起孵育，可以是具有該特異性表面標志的細胞溶解。利用這一原理，將消除細胞的特異性表面標志的抗體和補體加入細胞須阿畢業(yè)或細胞培養(yǎng)物中，使抗體及補體作用于具有相應(yīng)抗原的細胞并溶解之，而對該抗原陰性的細胞進行富集。細胞溶解法適用于細胞懸液或細胞培養(yǎng)物中待消除細胞數(shù)量不是很大的情況。

流式細胞分選術(shù)

流式細胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是70年代初發(fā)展起來的一項高新技術(shù)，綜合應(yīng)用光學(xué)、機械學(xué)、流體力學(xué)、電子計算機、細胞生物學(xué)、分子免疫學(xué)等學(xué)科技術(shù)，對高速流動的細胞或亞細胞進行快速定量測定和分析的方法。80年代開始從基礎(chǔ)研究發(fā)展到臨床醫(yī)學(xué)研究及疾病的診斷和治療監(jiān)測。

流式細胞術(shù)是對單個微粒（如細胞、微生物和人工合成微球等）進行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。在分析或分選過程中，包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號（分別代表熒光、散射光、光吸收或細胞光阻抗），送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計（flow cytometer）。

免疫磁珠分選技術(shù)

用免疫磁珠做細胞分選(MACS)是簡捷的免疫細胞及其它細胞的分離純化方法。 原理是已包被一抗的磁珠與細胞表面相應(yīng)分子特異性結(jié)合，或者已包被二抗的磁珠與預(yù)先已與細胞表面分子特異結(jié)合的一抗結(jié)合。磁珠攜帶與之結(jié)合的細胞吸附于分離柱/試管上，實現(xiàn)陽性細胞分離或陰性細胞的分離。

隨著20世紀科技的不斷發(fā)展，我們有望在不久的將來看到更加先進，更加便捷的干細胞分選技術(shù)，干細胞分選技術(shù)的發(fā)展與完善必將推動世界有關(guān)干細胞研究的加速前行。