牛血清白蛋白的分離純化

【實驗目的】  

掌握牛血清白蛋白分離純化各步驟（分段鹽析、離子交換層析）原理及操作方法。 

【實驗原理】 

鹽析法是一種利用蛋白質在不同濃度鹽溶液中溶解度不同而分離的方法。通過將鹽類加入到蛋白質溶液中，使蛋白質表面電荷被中和，水化膜被破壞，導致蛋白質在水溶液中的穩定性因素去除而沉淀。分段改變鹽類濃度達到分離目的的方法叫分段鹽析法。  DEAE-纖維素是一種應用廣泛的陰離子交換劑，它本身帶有正電荷，能不同程度地吸附溶液中的陰離子。層析時使用不同強度或不同PH值的緩沖溶液進行分段洗脫，含負電荷少的蛋白質首先被洗脫下來，含負電荷多的蛋白質后被洗脫下來，于是不同蛋白質被分開。 

【實驗器材】

 1.主要儀器   離心機、透析袋、磁力攪拌器、自動核酸蛋白質分離層析系統、分光光度計、水浴鍋。 

2.主要試劑

（1）小牛血清。 

（2）飽和硫酸銨溶液：稱取767g固體硫酸銨，加入1000ml水中，加熱使之溶解。室溫冷卻后4℃靜置一夜，然后用氨水將PH調至中性。 

（3）固體硫酸銨。

（4）聚乙二醇20000.

（5）DEAE-纖維素。 

（6）雙縮尿試劑：用適量蒸餾水分別溶解1.6克硫酸銅及6克酒石酸鉀鈉，移入1L容量瓶中。加10％NaOH300ml后，再加蒸餾水定容至1L及得。此溶液久藏不壞，但如果出現暗紅色沉淀，則不能使用。 

（7）0.05mol/L pH6.4PBS。 (8)0.12mol/L pH6.4PBS。 

【實驗方法】 

1.硫酸銨分段鹽析 

（1）量取20ml血清，倒入一干凈燒杯中，緩慢加入飽和硫酸胺溶液20ml，邊加邊攪拌。放入4℃冰箱30分鐘。 

（2）從冰箱中取出燒杯，將血清倒入一離心管，3000rpm離心20分鐘。 

（3）將上清液倒入一干凈量筒中，記錄體積，傾入另一干凈燒杯中，按17.6g/100ml的量稱取固體硫酸銨，緩慢加入上清液中，邊加邊攪拌，4℃冰箱30分鐘。

（4）3000rpm離心20分鐘，沉淀用4ml 0.05mol/L pH6.4PB溶解。

（5）將上述液體對0.05mol/L pH6.4PB透析，置夜。 

（6）用聚乙二醇20000濃縮至2-3ml。此蛋白粗提液留待層析。

 2.DEAE-纖維素離子交換層析 

（1）凝膠柱準備：連接自動核酸蛋白分離層析系統。夾住層析柱出口，加入1/3體積的0.05mol/L pH6.4PB，灌入層析劑，待層析劑自然沉降約2cm時，打開出口。層析柱填裝完成后，蓋好蓋，調節適當流速，平衡一夜，等待加樣。 

（2）加樣用吸管吸去膠面以上的緩沖液，立即加入蛋白粗提液（沿管壁緩慢加入）。 

（3）洗脫：打開出口，待蛋白粗提液*進入膠內后，用少量0.05mol/L pH6.4PB清洗管壁。用吸管補足層析柱膠面以上的緩沖液，用0.05mol/L pH6.4PB洗去2個層析柱體積，再換用0.12mol/L pH6.4PB洗脫并分部收集洗脫液。 

（4）檢測：用雙縮尿試劑檢測洗脫液。有蛋白質的收集管出現紫紅色，分別為*蛋白峰和第二蛋白峰。收集第二蛋白峰處的各管，4℃冰箱保存，標記為DEAE樣品。 

（5）回收層析劑。 

【注意事項】 

1.鹽析所用器皿一定要干燥。 

2.鹽析時，應將飽和硫酸銨或固體硫酸銨加入到血清中，且緩慢地邊加邊攪拌。

3.層析柱上方要留有少量液體，避免使層析劑暴露于空氣中。

4.上樣前，層析柱要達到平衡。 

5.上樣時，使樣品沿管壁緩緩流下，勿沖破膠面。

6.整個層析過程要控制好流速。