細胞培養注意事項

培養室內的無菌操作

細胞培養實驗所需的物品、器材應進行嚴格的滅菌或購買無菌的一次性物品。玻璃瓶可擰松瓶蓋滅菌（指高壓蒸汽滅菌，以下同）或用鋁箔紙包住瓶口，和瓶蓋分別滅菌。其它玻璃和金屬器材用鋁箔紙包裹進行滅菌。玻璃吸管應塞上棉花球滅菌，然后置于烘箱中烘干。不適于進行高壓滅菌的瓶塞等其它物品，可浸泡在70%酒精中進行滅菌，然后在超凈工作臺上吹干。細胞培養液和其它不適于高壓滅菌的溶液，應通過過濾（采用0.22μm的孔徑的濾膜）滅菌。無菌培養室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖地面一次，并用紫外線照射滅菌30分鐘。超凈工作臺每次使用前用70%酒精擦拭，然后紫外線照射30分鐘。

進入無菌操作室要求穿著無菌工作服、工作帽、口罩。開始工作前用70%酒精對手、前臂及乳膠手套進行消毒。細胞培養等操作應在超凈工作臺或有空氣過濾器的空間內進行。操作前點燃酒精燈，細胞培養的所有操作，如打開或關上試管或培養瓶蓋等，都要靠近酒精燈并經過短時間的灼燒。燒過的實驗器械，冷卻后才能使用。已吸過培養液或其它有機液體的吸管不得再用火焰燒灼。不同液體分別用不同的吸管吸取，不能混用。開蓋后的培養瓶盡量避免垂直放置，同時瓶蓋應扣放在超凈工作臺上，以減少落入細菌的機會。細胞培養物在處理和使用前，不要過早暴露于空氣中。在進行轉移液體操作時，移液器不能觸及瓶口以避免細菌污染或交叉污染。放置吸管時管口向下傾斜，以防止液體倒流引起污染。培養細胞的廢棄用品，應放入可封裝的容器內。

細胞培養樣品的采集

器材與試劑：1.眼科剪，彎鑷子、手術刀；2.裝有無血清培養液或PBS（KCl,2.7mM;KH₂PO₄,1.5mM;NaCl 136.9mM;Na₂HPO₄, 8.1mM）的小瓶； 3.10ml、50ml小燒杯；4. 培養皿。

操作步驟：

1. 采樣時應嚴格無菌操作。采樣時應用已滅菌的器械、無菌包裝的器皿和經過濾滅菌的緩沖溶液和培養液。采樣過程中盡量避免紫外線照射和接觸對細胞有毒害作用的化學試劑。在有污染因素存在的區域采樣時，應將樣品在含有500-1000U/ml的青、鏈霉素的PBS中漂洗3次，每次1-2分鐘。
2. 在條件允許的情況下，宜采細胞易存活、增殖速度快的胚胎組織。
3. 采樣時應用鋒利的器械切碎組織，盡可能減少對細胞的機械損傷。
4. 采樣時應切除采樣組織外的其它成份，如附著在采樣組織上的血液、脂肪、神經組織、結締組織和壞死組織。修剪和切碎過程中，應將樣品浸泡于少量培養液中，以避免組織干燥。
5. 采取的樣品應盡快培養。因故不能立即培養時，應將樣品切成1cm³以下的小塊，浸泡于培養液內，置于冰浴或4℃冰箱中。時間不能超過2小時。
6. 采樣的同時要留好組織學標本和電鏡標本，以便于以后鑒別原代組織的來源和觀察細胞體外培養后與原組織的差異性。對樣品的來源、供體的一般情況（包括性別、年齡、健康狀況等）要做詳細的記錄以備查詢。

細胞的原代培養

器材與試劑：1.離心機，眼科剪，牙科探針;2.培養瓶（皿），吸管，小燒杯；3.PBS緩沖液，細胞培養液。

操作步驟：

1. 對于樣品量較少的組織，采用組織塊培養法。

即將組織剪成小塊后接種于培養瓶（皿）。具體操作規程如下：

1. 將樣品切成1mm³左右的小塊。在剪切過程中，向樣品滴加少量培養液，以保持樣品濕潤。
2. 將剪切好的組織小塊，用眼科鑷子送入培養瓶（皿）內，用牙科探針或彎頭鑷子將組織塊在瓶壁上均勻擺置，小塊間距0.5cm左右。輕輕將培養瓶翻轉，讓放置樣品的瓶壁朝上，向瓶內注入適量培養液，蓋好瓶蓋，將培養瓶傾斜放置入二氧化碳培養箱中。
3. 放置3小時后，待組織小塊貼附后，將培養瓶慢慢翻轉平放，擰松瓶蓋，靜置培養。原代培養第4天時換液一次。

2 對大量樣品的培養，宜采用組織分離的方法培養。

2.1組織的分離

2.1.2 培養材料為血液、羊水、胸水和腹水等細胞懸液時，采用離心法分離。用小型臺式離心機1000 rpm（約110-120G的離心力）離心5分鐘（以下離心條件同），去除上清液。

2.1.3 對一些纖維成份很少的組織（如腦組織、部分胚胎組織以及一些腫瘤組織）進行分離處理時，在細胞培養液內用剪刀剪切后用吸管反復吹打分散細胞；或將樣品擠壓通過不銹鋼網(孔徑在80目以上)的方法進行分離。離心過濾液，收集細胞。去除上清液。

2.1.4 對于不適于上述兩種方法分離的樣品，采用消化分離方法，即將剪切成較小體積的組織塊通過胰蛋白酶或膠原酶消化進行進一步的分散。對細胞間質較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等組織宜使用胰蛋白酶。在進行消化時，用0.25%的胰蛋白酶，pH8的條件下在37℃消化20分鐘。對胰蛋白酶耐受性差的樣品，消化期間應通過顯微鏡隨時觀察消化情況，采用分次消化，及時把已消化分離下來的細胞與組織分開，放入含有血清的培養液中，更換消化液后再繼續消化。對于纖維性組織、上皮及癌組織宜使用膠原酶進行消化分離。消化時采用0.2μg/ml的膠原酶溶液37℃條件下消化4-48小時，可根據細胞分散的程度而定。在消化分離法中，隨時吸取少量消化液在顯微鏡下觀察，如發現組織已分散成細胞團或單個細胞，則終止消化。通過孔徑適當的篩網，濾掉未消化的樣品塊。已過濾的消化液1000 rpm離心5分鐘，去除上清，加含10%血清的培養液，輕輕吹打形成細胞懸浮液，再次離心，去除上清液。

2.2 加入含20%血清的細胞培養液，輕輕吸打離心后收集到的細胞，使之分散均勻。進行細胞計數，然后接種到含20%血清的細胞培養液的培養瓶（皿）中，松松蓋上瓶蓋，放入二氧化碳培養箱內培養。

2.3原代培養第4天時換液一次。

2.4對細胞原代培養所用試劑和主要參數進行記錄（見附表1）

傳代培養

器材與試劑：1.離心機、滴管、離心管、培養瓶（培養皿）、計數板;2.0.05% ～ 0.25% 胰蛋白酶消化液(溶液中含0.05% ～0.25%的胰蛋白酶,其它成份與PBS同)，細胞培養液^*，PBS緩沖液。

* 根據細胞種類不同選擇適當的細胞培養液。各主要類型的細胞培基（液）都已商品化，可在國內外生物制劑公司買到。有時需在商品化的細胞培基（液）中加入一些其它營養物質或生長因子以滿足一些特殊細胞種類的生長需要。

操作步驟：

1．貼壁生長的細胞的傳代培養

1.1 當原代培養后的細胞增殖至整個瓶（皿）壁被細胞覆蓋時（貼壁生長的細胞），棄去舊培養液。加入適量PBS緩沖液（5ml培養瓶加入2ml緩沖液），輕輕搖動培養瓶（皿），使緩沖液流過所有細胞表面。倒掉緩沖液，加入適量0.25%胰蛋白酶溶液（5ml培養瓶加入2ml胰蛋白酶溶液）。

1. 在37℃條件下消化3-5分鐘，隨時觀察消化情況。當細胞質回縮、細胞間隙增大或有細胞懸浮時，加入含10%血清的培養液，終止消化。
2. 用彎頭吸管吸取瓶（皿）內的培養液，反復輕柔吹打瓶（皿）壁，使細胞脫離瓶（皿）壁后懸浮于培養液中。
3. 離心，棄上清液，用含10%血清的培養液重新懸浮細胞。
4. 計數，分別接種在新的含10%血清的培養液的培養瓶（皿）內。
5. 當培養液的顏色呈黃色時（pH值下降），需要更換新的培養液。
6. 當細胞增殖至整個瓶（皿）壁時，需再次傳代培養。

2. 懸浮生長的細胞的傳代培養

2.1 將細胞同培養液一起轉移到離心管內，離心。

2.2 棄上清液，加入新的培養液，用吸管吹打使之形成細胞懸浮液。

2.3 對細胞進行計數和重新接種, 細胞的接種數量可從5×10⁴～8×10⁵ 個/ml。

2.4當培養液的顏色呈黃色時（pH值下降），需要進行換液。

2.5 當細胞增殖至覆蓋培養液表面時，需再次傳代培養。

3. 對得到的細胞系進行鑒定和命名。通過對所培養細胞的核型、同功酶、細胞表面抗原、細胞骨架、DNA的分析，以對細胞的物種、組織來源以及細胞是否發生轉化、有無交叉污染、有無遺傳不穩定傾向等進行鑒定。細胞系的命名宜采用4級命名法，即中文名由采樣的物種、品種、采樣組織、細胞系編號（用阿拉伯數字表示）組成；其縮寫名則由物種英文名稱的頭兩個字首、品種、采樣組織的英文的字首及細胞系編號組成。如從絲毛烏骨雞胚胎組織采樣所建立的成纖維細胞系1，其中文名為“絲毛烏骨雞胚胎成纖維細胞系1”，縮寫名為“ChSE1”。

4．多種細胞同時分別傳代培養時，操作時應小心仔細。為防止不同細胞系間的交叉污染，超凈工作臺中一次只進行一種細胞系的操作

5．培養箱中的細胞應經常置于顯微鏡下觀察，每周至少兩次，以檢查細胞是否生長正常和有無污染出現。

6．細胞傳代或更換培養液需要做記錄（見附表2和附表3）。記錄的內容包括組織的來源，生物學特性，培養液類型，傳代、換液的時間和規律，細胞的遺傳學標志，生長形態等。

細胞的保存（凍存）

器材與試劑：1.0.25%胰蛋白酶;2.含10% ～ 20% 的血清培養液；3.細胞凍存液（10% DMSO或經高壓（15磅）滅菌的甘油，20%血清，70%細胞培養液）；4.吸管、離心管、凍存管。

操作步驟：

1. 選擇培養至對數生長期的細胞（生長旺盛但尚未形成致密的單層細胞、長滿培養瓶（皿）以前）進行凍存。在凍存前一天換一次培養液。
2. 按照傳代的方法用胰蛋白酶把單層細胞消化下來，計數，離心收集細胞。
3. 棄去上清液，加入配制好的細胞凍存液，凍存液中細胞的zui終密度為5×10⁶/ml。用吸管輕輕將細胞吹打均勻，然后裝入凍存試管中，每管凍存1-1.5ml。在凍存試管上注明細胞系名稱、凍存日期和培養基的名稱。
4. 標準的凍存程序為，初期降溫速率為-1～-2℃每分鐘；當溫度達-25℃以下時，可增至-5～ -10℃每分鐘；至-100℃時，則可迅速浸入液氮中。裝入凍存試管的細胞可置于細胞凍存器中，在-80℃于夜后迅速放入液氮容器內凍存。如無此設備，可以用下兩種方法：一種是將凍存試管放入泡沫塑料盒或小紙盒中（用脫脂棉將其固定好）。放入-80℃冰箱中一夜，然后迅速放入液氮中；另一種是，將凍存試管緩緩放入液氮容器，按1℃每分鐘的降溫速度，在30-40分鐘內使其達到液氮表面，再停30分鐘后投入液氮內。低溫冷凍操作時應戴厚手套，以防凍傷。
5. 用布袋盛放凍存試管凍存時，用結實的線繩一端扎住袋口，與布袋一起沉入液氮中，線另一端系一個標簽，其上標明細胞系名稱、凍存日期和培養基的名稱，垂于液氮容器外；當用鐵架盛放凍存試管凍存時，鐵架和鐵架伸出液氮容器外的手柄上貼上標明細胞系名稱、凍存日期和培養基的名稱的標簽。
6. 對凍存的細胞系，需在凍存后兩周后復蘇一次，觀察細胞對凍存的適應性。對已建系的細胞每6個月復蘇培養一次，檢查其生長狀況和是否存在污染，然后再繼續凍存。
7. 細胞凍存應做記錄（見附表4）

細胞的復蘇

器材與試劑：1.水浴箱；2. 小型離心機；3. 吸管； 4.鑷子；5.細胞培養瓶（皿）；6.細胞培養液。

操作規程：

1. 從液氮容器內取出細胞凍存試管，用鑷子夾住在40℃水浴中不斷搖動，使其快速融化。操作時應戴厚手套，以防凍傷。
2. 當凍存試管內的液體*融化后，立即從40℃水浴中取出凍存試管，用70%酒精消毒，吸出細胞懸浮液，放入離心管中，并加入10倍體積以上的細胞培養液，混合后離心，棄去上清液，再用細胞培養懸浮，離心后用細胞培養液重新懸浮并計數。
3. 對復蘇后的細胞進行接種，接種密度以5×10⁵/ml為宜。然后放入二氧化碳培養箱中培養。
4. 冷凍細胞的復蘇應做記錄（見附表5）

細胞的運輸

器材與試劑：1.液氮或干冰;2. 凍存試管或培養瓶；3.細胞培養液。

操作規程：

1. 短時間的運輸可將細胞放入凍存試管凍存在液氮或干冰中運輸。
2. 長時間的運輸（達4～5天）可用以下方法：

2.1 選擇生長至中或晚對數期的細胞，棄去培養液，加入新培養液至瓶頸部，保留微量空氣，擰緊瓶蓋，用防水膠帶牢固地封好瓶蓋和瓶頸的結合部，并用泡沫塑料包裹。

2.2 到達目的地后，棄去多余的培養液，只保留維持細胞培養的液培養液量，放入二氧化碳培養箱進行培養，次日傳代。