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免疫組織化學染色方法

來源:通派(上海)生物科技有限公司   2012年10月18日 18:14  

 免疫組織化學染色法是指在抗體上結合熒光或可呈色的化學物質,利用免疫學原理中抗原和抗體間專一性的結合反應,檢測細胞或組織中是否有目標抗原的存在,此方式不只可以用來測知抗原的表現量也可觀察抗原所表現的位置。只要是能夠讓抗體結合的物質,也就是具有抗原性的物質包括蛋白質、核酸、多糖、病原體等都可偵測。免疫組織化學的優勢在于專一性、靈敏度、簡便快速以及成本低廉,所以廣為醫院采用,通常是借由特定的腫瘤標記來篩選癌癥。人類正常細胞株

 
 
實驗原理:
 
免疫細胞化學(immunocytochemistry)是根據免疫學原理,利用抗體同特定抗原專一結合,對抗原進行定位測定的技術。抗原主要為大分子或與大分子相結合的小分子;抗體則是由漿細胞針對特定的抗原分泌的γ球蛋白。如果將抗體結合上標記物,再與組織中的抗原發生反應,即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位。
 
常用的標記物有熒光素和酶。熒光素標記的稱為免疫熒光法(immunofluorescent technique),常用的螢光素有異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate)、羅丹明(rhodamine)等。酶標記的稱為酶標免疫法(enzyme-labeled antibody method),常用的酶有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase),酶與底物發生反應后形成不透明的沉積物,從而顯示出抗原存在的部位。
 
抗體與抗原的結合方法可分為直接法和間接法兩種,直接法是將帶有標記的抗體與抗原反應,顯示出抗原存在的部位。而間接法則是在抗體抗原初級反應的基礎上,再用帶標記的次級抗體同初級抗體反應,從而使初級反應得到放大,顯示增強。
 
 
實驗步驟:
 
1. 石蠟切片4-5μm;
 
2. 切片脫蠟至水;
 
3. 3%甲醇雙氧水阻斷室溫10分鐘;
 
4. 0.01M(PH 7.2)磷酸鹽緩沖液()洗5分鐘´3次;抗原修復,加入0.01M(PH 6.0)檸檬酸緩沖液置微波爐中10檔3分30秒,之后可進行2檔1分至1分30秒微波維持。
 
5. 自然冷卻后洗,加二抗同種動物非免疫血清封閉,室溫10分鐘;
 
6. 免洗,傾出血清,分別滴加配制好的一抗4℃過夜;
 
7. 洗5分鐘 ´ 3次;
 
8. 滴加生物素標記的第二抗體,室溫孵育10分鐘;免疫組化抗體
 
9. 洗5分鐘 ´ 3次;
 
10. 滴加鏈親和素-過氧化物酶,室溫10分鐘;
 
11. 洗5分鐘 ´ 3次;
 
12. 新鮮配制的DAB溶液顯色3-10分鐘;
 
13. 自來水洗,蘇木素淺染細胞核,分化。自來水沖洗返蘭,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。

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