1.樣品處理（樣本處理區）

1.1樣本前處理

取待檢樣品組織，加入 4 倍體積的 TE，勻漿化；將勻漿化的組織反復凍融 3 次，3000 r/min離心 30 min，取上清液。其他樣品前處理可參考 SNT4053-2014。

1.2核酸提取

推薦采用公司生產的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請按照試劑說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區）

根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

試劑 反應液酶液

用量（樣本數為 N）19μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL /管。

3.加樣（樣本處理區）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環參數設置：

步驟循環數溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應結束后自動保存結果，根據分析后圖像調節 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據實際情況自行調整，Start 值可以在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數器，陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結果。

5.2結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數增長曲線； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質控標準

陰性質控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數增長期，且Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。