羅氏實時熒光定量PCR儀（LightCycler®系統）工作原理

實時熒光定量PCR（Quantitative PCR, qPCR）是一種結合PCR擴增和熒光檢測的技術，能夠對DNA或RNA進行精確定量。羅氏（Roche）的LightCycler®系列儀器（如LightCycler® 480）采用閉管檢測方式，通過監測PCR過程中熒光信號的變化，實現核酸的實時定量分析。其核心工作原理可分為以下幾個部分：

1. PCR擴增與熒光檢測的結合

實時熒光定量PCR在傳統PCR的基礎上引入熒光標記探針或染料，使擴增過程可以被實時監測。羅氏LightCycler®系統的主要檢測方式包括：

(1) 基于熒光探針的檢測（如TaqMan探針）

• 探針結構：

• 探針兩端分別標記熒光報告基團（如FAM）和淬滅基團（如TAMRA或BHQ）。

• 探針與目標DNA序列互補結合。

• 工作原理：

• 在PCR延伸階段，Taq DNA酶發揮5'→3'外切酶活性，切割探針，使報告基團與淬滅基團分離。

• 報告基團釋放熒光信號，其強度與PCR產物量成正比。

(2) 基于DNA結合染料的檢測（如SYBR Green）

• 染料特性：SYBR Green可非特異性地結合雙鏈DNA，并在激發后發出熒光。

• 檢測方式：

• 每輪PCR循環后，檢測熒光強度，反映雙鏈DNA的累積量。

• 需配合熔解曲線分析（Melting Curve Analysis）驗證擴增特異性。

2. 光學檢測系統

羅氏LightCycler®儀器采用多通道熒光檢測，主要流程如下：

1. 激發光源：LED或鹵素燈提供特定波長的激發光（如470nm、530nm等）。

2. 熒光采集：

• 光學傳感器在每輪PCR循環后掃描各孔熒光信號。

• 支持多重檢測（如FAM、HEX、ROX、Cy5等不同熒光通道）。

3. 信號處理：

• 軟件記錄熒光強度變化，生成擴增曲線（Amplification Plot）。

3. 定量分析原理

(1) 閾值循環數（Ct值）

• Ct值（Threshold Cycle）：熒光信號達到設定閾值所需的PCR循環數。

• 定量依據：

• 初始模板量越高，Ct值越小；反之，Ct值越大。

• 通過標準曲線法（絕對定量）或ΔΔCt法（相對定量）計算目標核酸濃度。

(2) 標準曲線法（絕對定量）

1. 使用已知濃度的標準品（如質粒DNA）進行梯度稀釋并擴增。

2. 繪制Ct值-log(起始拷貝數)標準曲線。

3. 根據待測樣本的Ct值，計算其初始模板量。

(3) 熔解曲線分析（特異性驗證）

• 適用情況：使用SYBR Green等非特異性染料時。

• 原理：

• PCR結束后，緩慢升溫（如60°C→95°C），使雙鏈DNA解鏈。

• 監測熒光信號隨溫度的變化，生成熔解曲線。

• 單一峰表示特異性擴增；多峰提示引物二聚體或非特異性產物。

4. 羅氏LightCycler®系統的技術特點

1. 快速溫控：

• 采用Peltier半導體技術，升降溫速率可達4.8°C/秒，縮短實驗時間。

2. 多重檢測能力：

• 支持4–6色熒光通道，可同時檢測多個靶標（如病原體分型）。

3. 閉管操作：

• 減少開蓋污染風險，提高檢測穩定性。

5. 應用示例

• 病毒載量檢測（如HIV、HBV）：通過Ct值定量病毒RNA/DNA。

• 基因表達分析（qRT-PCR）：比較不同樣本中mRNA的相對表達量。

• 突變檢測：結合高分辨率熔解曲線（HRM）分析SNP或點突變。

6. 注意事項

• 引物/探針設計：需確保特異性，避免交叉反應。

• 防污染措施：使用UNG酶（尿嘧啶-DNA糖基化酶）降解殘留PCR產物。

• 儀器校準：定期進行光學校準和溫度驗證，保證數據準確性。

總結

羅氏實時熒光定量PCR儀通過熒光標記探針或染料實時監測PCR擴增，結合多通道光學檢測和Ct值分析，實現核酸的精確定量。其核心技術優勢在于快速溫控、多重檢測和閉管操作，適用于臨床診斷、科研及工業檢測等領域。實驗成功的關鍵在于優化反應體系、規范操作流程并定期維護儀器。