Stretch-induced damage in endothelial monolayers

Keywords: Aging; Cell mechanics; Endothelium; Mechanobiology; Senescence; Stretch.

由于血流的脈動(dòng)性，包括流體剪切力、壓力和循環(huán)拉伸在內(nèi)的幾種血流動(dòng)力學(xué)力在體內(nèi)作用在內(nèi)皮層。內(nèi)皮細(xì)胞感知這些機(jī)械刺激，并通過機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制調(diào)整其形態(tài)和功能，以維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)和屏障完整性。循環(huán)拉伸拉伸影響幾個(gè)關(guān)鍵的內(nèi)皮細(xì)胞功能。生理拉伸（5-15%）維持血管穩(wěn)態(tài)，而超生理水平（>20%）啟動(dòng)生化途徑，可能導(dǎo)致疾病進(jìn)展。

內(nèi)皮細(xì)胞形成單細(xì)胞層，排列在血管和淋巴管的內(nèi)表面。它們?cè)谘夯蛄馨团c周圍組織之間形成屏障，控制分子的雙向運(yùn)輸。內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)及其機(jī)械特性會(huì)隨著細(xì)胞衰老（cell senescence）而變化，這是一種以增殖停滯為特征的細(xì)胞命運(yùn)。單層中衰老細(xì)胞的存在與細(xì)胞間連接受損和高通透性有關(guān)。老化（aging）會(huì)引起細(xì)胞力學(xué)的變化，通過其結(jié)構(gòu)組成（即細(xì)胞骨架、黏著斑、核力學(xué)）和化學(xué)機(jī)械途徑（如 Hippo、RhoA）的表型變化來影響細(xì)胞對(duì)機(jī)械力的感覺和反應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)細(xì)胞進(jìn)行快速和高拉伸，可以識(shí)別表型被動(dòng)和主動(dòng)機(jī)械反應(yīng)的明顯差異。在蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院機(jī)械與工藝工程系、蘇黎世大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究所的進(jìn)一步研究中，將內(nèi)皮單層暴露在不同水平的快速單軸拉伸下，以確定它們的拉伸極限，并展示了它們的彈性和恢復(fù)能力如何受到老化和衰老的影響。研究成果發(fā)表于 Biomaterials Advances 期刊題為“Stretch-induced damage in endothelial monolayers”。

首先，為了評(píng)估非衰老與衰老和老化單層細(xì)胞對(duì)不同瞬時(shí)拉伸水平的反應(yīng)，測(cè)試了三種不同的細(xì)胞群：HUVEC、TNF-α處理的 HUVEC 和單供體 > 50 歲的 HSaVVEC。在 TNF-α處理的 HUVEC（體外衰老模型）和 HSaVVEC 中檢測(cè)到較高的 SA-β-gal 陽(yáng)性細(xì)胞，表明這些細(xì)胞群存在基礎(chǔ)水平的衰老。此外，還檢測(cè)到反映衰老和老化表型的其他特征，如形狀擴(kuò)大、Claudin-5和 VE-cadherin在連接處的定位受損及整體下調(diào)、黏著斑復(fù)合物分子磷酸化Paxillin的上調(diào)。因此，研究中使用的三種不同的內(nèi)皮細(xì)胞類型可能代表以下表型：1）HUVEC – 年輕/非衰老；2）HUVEC TNF-α – 衰老；3）HSaVVEC – 老化/衰老。

與相對(duì)未處理的對(duì)照相比，HUVEC TNF-α 中的局部細(xì)胞密度顯著降低，與 HSaVVEC 單層相似（圖1 A、B），進(jìn)一步證實(shí)了衰老特性。通過 β-連環(huán)蛋白染色的 IF 圖像分割，發(fā)現(xiàn) HSaVVEC 中空隙區(qū)域更大（圖1 B），表明單層完整性較低。HUVEC TNF-α細(xì)胞間連接處的 SEM 圖像顯示，絲狀偽足跨越間隙伸展（圖1 C），表明與對(duì)照相比，屏障被破壞。總之，每種表型的描述如下：年輕/非衰老——高密度，高單層完整性；衰老——低密度，中等單層完整性；老化/衰老——低密度，低單層完整性。

為了評(píng)估細(xì)胞對(duì)急性拉伸的即時(shí)和后續(xù)反應(yīng)，將體外單軸雙穩(wěn)態(tài)裝置用于拉伸內(nèi)皮單層。圖1 D-F 顯示了 40% 單軸應(yīng)變對(duì)年輕、衰老和老化/衰老細(xì)胞的瞬時(shí)和延遲效應(yīng)的代表性圖像。通過量化拉伸應(yīng)用后的空隙面積來評(píng)估造成的損害，發(fā)現(xiàn)每種細(xì)胞類型都顯示出明顯的差異。

HUVEC 單層對(duì)拉伸的耐受最高。在 40-50% 應(yīng)變下，瞬時(shí)空隙百分比面積絕對(duì)增加僅為 1.8%（圖1 G）。它們形成許多小空隙（圖1 D、G），這些空隙累積成一個(gè)小的瞬時(shí)空隙區(qū)域（圖1 G）。在延遲條件下，即使在超生理應(yīng)變值（>15%）下，HUVEC 也會(huì)擴(kuò)散以覆蓋任何最初受損的空隙區(qū)域并重組它們的細(xì)胞間連接，恢復(fù)完整的單層（圖1 D、G、K）。

HUVEC TNF-α 單層可耐受生理水平的應(yīng)變（即高達(dá) 10-20%）。在 20-30% 應(yīng)變下，延遲空隙面積的絕對(duì)值顯著增加 3.4%（圖1 H）。在 10-20% 的生理范圍內(nèi)顯示出單層完整性恢復(fù)潛力，瞬時(shí)和延遲條件之間的空隙數(shù)量大大減少，并且對(duì)照和延遲空隙百分比面積之間沒有顯著差異。在較大的應(yīng)變下，相對(duì)于瞬時(shí)條件，延遲損傷增加，由于細(xì)胞分離而形成大空隙（圖1 E、H、L）。

有趣的是，HSaVVEC 單層對(duì)拉伸最敏感（圖1 C、F、I）。40–50% 的應(yīng)變條件下，延遲空隙面積方面顯示出最大的絕對(duì)增加（圖1 F），即使在低應(yīng)變（10-20%）下也顯著增加（圖1 J）。隨著小空隙和大空隙的形成，空隙數(shù)量（空隙計(jì)數(shù)）立即增加，而與靜態(tài)控制相比，延遲的空隙計(jì)數(shù)變化是微不足道的，因?yàn)榇罅考?xì)胞分離導(dǎo)致很少的大空隙（圖1 J、M）。

為了進(jìn)一步證明拉伸的超生理水平損害了細(xì)胞，對(duì) HUVEC 和 HUVEC TNF-α 單層的瞬時(shí)樣本進(jìn)行了基于膜完整性的活/死細(xì)胞活力測(cè)定。應(yīng)用 40% 單軸應(yīng)變10分鐘后，鑒定的 HUVEC 細(xì)胞中 0.1% 被標(biāo)記為死亡，而 2.7% 的 HUVEC TNF-α 細(xì)胞被標(biāo)記死亡。死細(xì)胞數(shù)量的增加表明，衰老單層細(xì)胞比年輕單層細(xì)胞對(duì)拉伸更敏感、脆弱，并表明拉伸誘導(dǎo)的損傷是 30 分鐘延遲時(shí)間條件下觀察到的細(xì)胞死亡和隨之而來的脫離的原因。

圖 1     靜態(tài)培養(yǎng)（頂部-靜態(tài)）和快速單軸拉伸（底部-拉伸）后內(nèi)皮單層的表征。

為了表征內(nèi)皮單層中形成的損傷，分析了拉伸細(xì)胞的高倍率 IF 和 SEM 圖像。具體來說，在 40% 應(yīng)變的 HUVEC 單層中，只檢測(cè)到應(yīng)變的細(xì)胞間連接之間存在細(xì)胞間空隙（圖2 A、D、F）。相反，在 HUVEC TNF-α 和 HSaVVEC 的衰老單層中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)空隙的混合物（圖2 B、C、E、G）。此外，對(duì)于 HUVEC TNF-α，與 HUVEC 對(duì)照相比，細(xì)胞間空隙更大，細(xì)胞間連接斷裂明顯更多（圖2 E、G）。在衰老和老化的單層細(xì)胞中觀察到大的細(xì)胞內(nèi)空隙（圖2 B、C）是跨壁的，并伴有似乎已經(jīng)解離的細(xì)胞膜（圖2 G）。因此，進(jìn)行了活/死測(cè)定，結(jié)果表明在拉伸之前，HUVEC 對(duì)照和 HUVEC TNF-α 細(xì)胞都是活的。在拉伸的 HUVEC TNF-α 單層中，膜完整性受損。有趣的是，盡管在瞬時(shí)拉伸的衰老細(xì)胞群的 IF 圖像中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)空隙，但在相應(yīng)的延遲樣本中未發(fā)現(xiàn)它們，這表明這些空隙可能導(dǎo)致細(xì)胞快速死亡和脫離。

既往報(bào)道稱，衰老影響內(nèi)皮機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響細(xì)胞行為并導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)展。因此，接下來探討了在急性超生理水平拉伸的老化和衰老細(xì)胞所表現(xiàn)出的較高脆弱性是否也會(huì)在周期性施加的生理水平應(yīng)變中檢測(cè)到。利用雙軸拉伸裝置，在1 Hz頻率下對(duì)單層細(xì)胞進(jìn)行18 h的循環(huán)雙軸拉伸，最高可達(dá)約15% 的雙軸應(yīng)變。與急性拉伸結(jié)果一致，HUVEC TNF-α 和 HSaVVEC 對(duì)生理周期拉伸也更敏感，這損害了單層完整性。與靜態(tài)對(duì)照組相比，衰老組和老化組在應(yīng)變 >10 % 時(shí)測(cè)得空隙面積顯著增加，而年輕 HUVEC 單層耐受循環(huán)拉伸，這表明在所有水平的循環(huán)拉伸中單層膜都保持融合。

圖2    單軸延伸的細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)空隙的免疫熒光（IF）和掃描電子顯微鏡（SEM）圖像。

由于對(duì)非常快速拉伸的即時(shí)反應(yīng)不是由生物過程介導(dǎo)的，假設(shè)純機(jī)械計(jì)算模型可以提供相關(guān)見解，以合理化年輕和老化/衰老內(nèi)皮細(xì)胞之間損傷形成的差異。利用內(nèi)皮單層計(jì)算模型進(jìn)行單軸拉伸模擬，對(duì)兩個(gè)級(jí)別的伸長(zhǎng)率進(jìn)行了計(jì)算：20 % 和 40 %。

實(shí)驗(yàn)研究了細(xì)胞大小是否可以單獨(dú)證明細(xì)胞損傷的差異，因?yàn)槔匣退ダ系膬?nèi)皮細(xì)胞被證明體積更大。由小細(xì)胞或大細(xì)胞組成的單層細(xì)胞內(nèi)能量沒有差異，而大細(xì)胞在 40% 應(yīng)變下表現(xiàn)出略大的細(xì)胞間能量。然而，沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)能量的差異，從而得出結(jié)論，僅細(xì)胞大小不能解釋在老化/衰老細(xì)胞中觀察到的細(xì)胞內(nèi)空隙形成。此外，在單層中大細(xì)胞的細(xì)胞間連接處發(fā)現(xiàn)更高的能量密度，表明這些過渡區(qū)域可能承受更高的應(yīng)力，因此更有可能形成細(xì)胞間空隙。

根據(jù)之前關(guān)于年輕、衰老、老化/衰老細(xì)胞之間細(xì)胞-基質(zhì)粘附差異的發(fā)現(xiàn)，假設(shè)細(xì)胞-基質(zhì)粘附增加會(huì)導(dǎo)致更多的仿射變形，從而導(dǎo)致更高的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力，在衰老細(xì)胞中引起相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)空隙。文獻(xiàn)支持隨著衰老而增加黏著斑密度和細(xì)胞-基質(zhì)粘附力的趨勢(shì)，并且顯示黏著斑大小顯著增加。因此，為了匹配老化和衰老內(nèi)皮細(xì)胞的表型特征，研究了改變黏著斑密度（圖3 A、B）和大小對(duì)計(jì)算的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間變形能量分量的綜合影響。

增加黏著斑密度和大小導(dǎo)致更高的細(xì)胞內(nèi)能量密度（應(yīng)力纖維，圖3 C），而細(xì)胞間連接的細(xì)胞間能量降低（圖3 D）。這支持了老化和衰老表型中更高的損傷易感性和細(xì)胞內(nèi)損傷的存在。對(duì)于可能發(fā)生較少仿射變形的年輕表型，細(xì)胞間連接處的應(yīng)力更高，這可能支持對(duì)細(xì)胞間瞬時(shí)損傷的更高敏感性。較高的粘附性導(dǎo)致較低的細(xì)胞間變形能量，而 TNF-α處理的 HUVEC 中的相應(yīng)空隙比 HUVEC 大。這與以前的發(fā)現(xiàn)一致，即衰老細(xì)胞的連接通常不如年輕細(xì)胞穩(wěn)定。

根據(jù)計(jì)算結(jié)果，假設(shè)減少老化/衰老細(xì)胞的仿射變形會(huì)減少細(xì)胞內(nèi)空隙的形成。為此，用 β1-整合素阻斷抗體處理 HUVEC-TNF α內(nèi)皮單層。阻斷抗體的處理顯示蛋白質(zhì)印跡中磷酸化黏著斑激酶（p-FAK）和樁蛋白減少（圖3 E、F），表明已建立的黏著斑。此外，黏著斑密度降低（圖3 G、H）。然后，將這些細(xì)胞與對(duì)照組一起進(jìn)行快速單軸拉伸，阻斷 β1-整合素可阻止細(xì)胞內(nèi)空隙的形成（圖3 I），并將空隙形成轉(zhuǎn)移到更大的細(xì)胞間空隙。此外，與 40% 應(yīng)變情況下的對(duì)照組相比，從瞬時(shí)到延遲情況下空隙百分比面積的倍數(shù)變化往往較低（圖3 J）。因此，證實(shí)了實(shí)驗(yàn)的假設(shè)，衰老細(xì)胞中黏著斑的減少不僅防止了在高應(yīng)變下可瞬間檢測(cè)到的細(xì)胞內(nèi)空隙，還減少了瞬時(shí)拉伸后延遲空隙區(qū)域的形成。這表明黏著斑的減少可以減少細(xì)胞內(nèi)損傷和與之相關(guān)的即將發(fā)生的脫離。

圖3     模擬單軸拉伸實(shí)驗(yàn)的內(nèi)皮細(xì)胞單層計(jì)算模型，同時(shí)在年輕（小和低黏著斑密度）衰老（大和高黏著斑密度）之間改變細(xì)胞表型。

總之，該研究確定了內(nèi)皮變形與細(xì)胞損傷之間的定量關(guān)系。衰老和老化降低了內(nèi)皮細(xì)胞的拉伸彈性，并影響了單層細(xì)胞的損傷方式。對(duì)于衰老和老化的內(nèi)皮細(xì)胞表型，研究表明，超生理水平的急性拉伸可誘導(dǎo)可能致命的大細(xì)胞內(nèi)破裂。對(duì)于年輕的表型，存在較大的超生理變形的細(xì)胞間空隙，但這種瞬時(shí)損傷可以在短時(shí)間內(nèi)愈合。根據(jù)計(jì)算建模結(jié)果，衰老或老化內(nèi)皮細(xì)胞的脆弱性可歸因于與細(xì)胞-基質(zhì)粘附增加相關(guān)的更多仿射變形。這些觀察結(jié)果可能與未來的臨床應(yīng)用相關(guān)，如血管成形術(shù)的支架置入術(shù)和控制藥物輸送系統(tǒng)。

參考文獻(xiàn)：Choi Y, Jakob R, Ehret AE, von Bohemer L, Cesarovic N, Falk V, Emmert MY, Mazza E, Giampietro C. Stretch-induced damage in endothelial monolayers. Biomater Adv. 2024 Oct;163:213938. doi: 10.1016/j.bioadv.2024.213938. Epub 2024 Jun 28. PMID: 38959650.

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