Retinal ganglion cells induce stem cell-derived neuroprotection via IL-12 to SCGF-β crosstalk

KWS：Retinal ganglion cells；stem cell；neuroprotection；IL-12；SCGF-β；crosstalk

中樞神經系統（CNS）神經元變性發生在許多疾病中，如青光眼等，這些神經元在損傷后通常無法存活或再生。各種干細胞群已被證明可以通過其分泌組促進神經保護。例如，來自間充質干細胞（MSCs）的分泌組已被證明在心血管、泌尿生殖系統和腫瘤疾病的再生治療中具有巨大潛力，并且在包括缺血性、創傷性和炎癥性在內的多種損傷下，在整個 CNS 中顯示出神經保護能力。特別是，在實驗性青光眼模型中，MSCs 通過分泌血小板衍生生長因子（PDGF）等神經保護因子來促進宿主視網膜神經節細胞（RGC）存活。

研究發現，多能干細胞（iPSCs）是神經保護的另一種有效來源，至少部分是通過分泌尚未確定的可擴散神經保護因子來實現的。考慮到體內干細胞移植的轉化挑戰，發現 iPSC 衍生的神經保護因子和/或調節相關的信號通路可能是更安全、更有效的 CNS 神經元變性治療方法，但對于受損或退化的神經元如何與供體干細胞相互作用以最大限度地提高自身存活率知之甚少。

基于此，上海視覺損害與重建重點實驗室及斯坦福大學醫學院斯賓塞視覺研究中心聯合團隊進行了深入研究，通過建立一個細胞間相互作用模型，發現了 iPSCs 對 RGCs 的神經保護作用，并確定了介導神經元誘導的干細胞衍生神經保護的關鍵信號分子。研究成果發表于 Stem Cell Research & Therapy 期刊題為“Retinal ganglion cells induce stem cell-derived neuroprotection via IL-12 to SCGF-β crosstalk”。

作為非增殖性細胞，一旦在體內分離，即使在精細的培養條件下，RGCs 也會逐漸自行死亡。實驗首先檢測了 iPSC 上清液是否直接促進 RGC 體外存活。5 天后，未觀察到響應 iPSC 培養上清液的 RGC 活性變化。這與之前的研究結果一致，iPSC-RGC 間接共培養顯著提高了 RGC 的活力。這些結果表明，iPSC-RGC 相互作用，而不是單獨培養的 iPSCs，促進了 RGC 的存活。

然后，驗證 RGC 衍生的分泌組是否誘導 iPSCs 保護 RGCs。在各種特定的條件培養基中培養 5 天后（圖1 A）中，僅在 iPSC 衍生的上清液中觀察到 RGC 活性的顯著增加，其中 iPSCs 被 RGC 條件培養基刺激（圖1 B）。值得注意的是，沒有 RGC 衍生刺激的 RGC 條件培養基和 iPSC 條件培養基的組合對 RGC 存活沒有影響（圖1 B）。因此，iPSC 的神經保護作用是由與 RGC 共培養或來自 RGC 的可溶性信號誘導的。

圖1    RGC 上清液誘導 iPSC 的神經保護作用。

根據上述發現，進一步確定負責 iPSC 衍生的 RGC 神經保護的候選信號。通過基于多重抗體的檢測對 RGC-iPSC 條件培養基和 iPSC 條件培養基中 47 種細胞因子的濃度進行測試，結果觀察到干細胞生長因子-β（SCGF-β）濃度顯著升高。此外，使用 RT-qPCR 在 RGCs 中未檢測到 CLEC11A（SCGF 編碼基因）mRNA，表明檢測到的 SCGF-β 來源于 iPSCs。

然后，探討了人類 iPSC 衍生的 SCGF-β 是否足以且必要的參與 iPSC 誘導的 RGC 神經保護。培養 5 天后，在含有 10 ng/mL  SCGF-β 的培養基中培養的 RGCs 中觀察到 RGC 活性顯著增加。相比之下，在 RGC 共培養試驗中，與對照 iPSC 系相比，CLEC11A-KO iPSCs 對 RGC 存活的促進作用顯著降低。因此，SCGF KO 耗盡了 iPSCs 的神經保護能力。此外，還檢測了 SCGF-β 是否促進視神經壓迫后 RGC 的體內存活，并發現在用 SCGF-β 治療的小鼠中，視神經壓迫后 5 天，RBPMS+ RGC 密度顯著增加，證明了 SCGF-β 的體內神經保護能力。

接下來，為了探索 RGC 介導的這種 iPSC神經保護性表型誘導和 iPSC SCGF-β 釋放上調的分子基礎，再次使用了基于多重抗體的測定。在 23  種小鼠細胞因子中，白細胞介素12（p70）在RGC 上清液中檢測到，而在 RGC 培養基中未檢測到（圖2 A）。這一發現通過 ELISA 進一步得到驗證（圖2 B）。在 iPSC 培養物中發現 SCGF-β 分泌的劑量依賴性誘導，且在 5 ng/mL 的 IL-12（p70）處達到峰值（圖2 C）。RT-qPCR 同樣顯示，IL-12（p70）處理后 iPSCs 中 CLEC11A mRNA 表達顯著增加，具有相同的峰值（圖2 D）。重要的是，IL-12（p70）不會直接促進 RGC 存活，直到濃度比誘導 iPSC 分泌 SCGF-β 的濃度高 16 倍（圖2 E）。因此，RGC 衍生的 IL-12（p70）上調 iPSC 的 SCGF-β 表達和分泌。

圖2    RGC 通過 IL-12（p70）增強 iPSC 的 SCGF β釋放。

從qRT-PCR 結果中，發現神經生成素2（ngn2）是一種關鍵的神經發生調節因子，在與 iPSCs 共培養的 RGCs 以及用 SCGF-β 處理的 RGCs 中顯著上調。這些發現提出了 ngn2 參與 iPSC 衍生的 SCGF-β 的神經保護作用的假設。通過外源性表達，ngn2 在體外 1 周后導致 RGC 活性顯著增加。相反，在 ngn2 敲低的 RGCs 中 SCGF-β 的 RGC 保護作用丟失。這些結果表明，ngn2 是 SCGF-β 促進 RGC 體外存活的必要和充分條件。

最后，檢測了 ngn2 是否足以在體內促進 RGC 神經保護。實驗觀察到，視神經損傷2周后，玻璃體內注射 AAV2-ngn2 的小鼠 RBPMS+ RGC 密度顯著增加（圖3 A、B），表明 ngn2 過表達可保護視神經損傷后 RGC 的存活。

考慮到這種對內源性 RGCs 的神經保護作用，進一步探討了在成年大鼠玻璃體內移植的 RGCs 中過表達 ngn2 是否會增加供體細胞的存活率。許多活的 RGCs 在不規則的群體中被發現，而其他的則廣泛分散（圖3 C）。移植的 ngn2 過表達的 RGCs 顯示出明顯更高的存活率（圖3 D）。ngn2 的過表達還延長了移植 RGCs 的平均神經突長度（圖3 E）。因此，ngn2 過表達促進 RGC 在體內存活，包括視神經損傷后的宿主 RGCs 和視網膜移植后的供體 RGCs。

圖3    ngn2 的過表達可保護內源性和移植的 RGC。

圖4    RGC 衍生的 IL-12（p70）激活 iPSCs 分泌 SCGF-β，然后通過上調 ngn2 介導 RGC 神經保護。

綜上所述，該研究確定了 iPSC 衍生的 SCGF-β 和 RGC 中 ngn2 的下游誘導對干細胞的神經保護作用至關重要，并進一步證明退化的 RGC 通過其分泌的 IL-12（p70）向 iPSC 發出信號，使其具有神經保護表型。這項研究指出了一種新的信號通路，即 IL-12（p70）-SCGF-β-ngn2 信號軸，受損的神經元通過該通路與干細胞相互作用以調用自身的神經保護。

參考文獻：Xia Q, Chang KC, Sun Y, Nahmou M, Noro T, Cheng Y, Kong X, Mo X, Goldberg JL, Wu S. Retinal ganglion cells induce stem cell-derived neuroprotection via IL-12 to SCGF-β crosstalk. Stem Cell Res Ther. 2025 Feb 25;16(1):90. doi: 10.1186/s13287-025-04198-5. PMID: 40001251; PMCID: PMC11863831.

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