關鍵詞：Ⅰ型5α-還原酶，Ⅱ型5α-還原酶，肝5α-還原酶，睪丸5α-還原酶，睪酮，二氫睪酮，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)，非那雄胺，化妝品控油功效，5α-Reductase，5αR1，5αR2，SRD5A1，SRD5A2，Testosterone，Dihydrotestosterone(DHT)，Finasteride

隨著化妝品行業的功效細分，功效宣稱的規范，消費者對自己皮膚的狀態越來越關注，針對不同膚質也會選擇不同功效的護膚品。當前，皮膚油膩逐漸成為困擾年輕人的主要問題，消費者對于具有控油功效的化妝品的需求呈現日益增長的趨勢。皮膚油膩與皮脂腺細胞過度分泌油脂有關，其中，5α-還原酶（5α-Reductase）是皮膚油脂分泌的一個關鍵限速酶，其活性與皮脂腺的油脂分泌情況有著緊密的聯系。化妝品功效成分如果能夠抑制5α-還原酶活性，則能有效地調節皮脂腺細胞的活性，減少油脂的分泌，從而起到控油的作用。因此，5α-還原酶活性抑制試驗是評價化妝品控油功效的關鍵指標。

01    5α-還原酶簡介

5α-還原酶（5α-Reductase，5αR）是定位于靶細胞微粒體上的膜蛋白，是雄激素睪酮( Testosterone,T)代謝的關鍵酶，共包含Ⅰ型（SRD5A1）、Ⅱ型（SRD5A2）和Ⅲ型（SRD5A3）三種同工酶。其中，Ⅰ型5α-還原酶（5αR1）主要分布于肝臟、皮脂腺、汗腺等器官，發揮生理作用的最適pH為6~9；Ⅱ型5α-還原酶（5αR2）主要分布于前列腺、睪丸、附睪、精囊、頭皮毛囊等，作用最適pH為5.5；而Ⅲ型5α-還原酶（5αR3）研究較少，其在難治愈的前列腺癌中過度表達。

5αR可在還原型輔酶Ⅱ(NADPH) 提供電子的條件下將睪酮上4、5位不飽和雙鍵還原，并轉化為更具活性的二氫睪酮（Dihydrotestosterone，DHT）。二氫睪酮作為一種比睪酮更強效的雄激素，可加速人皮脂腺細胞的增殖并促使皮脂分泌亢進，易導致皮膚油膩等問題（圖1）出現，給人們帶來巨大的心理壓力, 影響工作與生活。因此，通過抑制5α-還原酶的活性以減少皮脂分泌來評價化妝品控油功效，并將其運用于控油、痤瘡等醫藥健康產品領域，其具有重要的研究價值和廣闊的市場前景。

圖1 5α-還原酶在皮膚油脂分泌中的作用（來源：基于人5α還原酶活性試驗對化妝品控油原料的篩選）

02    5α-還原酶活性抑制試驗與化妝品控油功效評價

根據化妝品功效宣稱評價項目要求（表1），控油功效宣稱評價方法有三種：人體功效評價試驗、消費者使用測試和實驗室試驗方法，配以文獻數據支持。其中人體功效和消費者測試這兩種方法為人體方法，所需的成本高，周期長。目前市場上認可最多的就是體外實驗室試驗法，實驗室試驗認可的方法有：皮脂腺細胞試驗和5α-還原酶活性抑制試驗。

皮脂腺細胞試驗由于細胞的特性，不宜用低毒性或者高于低毒性的化妝品進行檢測，易使細胞失去活性。因此：5α-還原酶活性抑制試驗是化妝品控油功效評價最常使用的方案。

表1 化妝品功效宣稱評價項目要求

03    IPHASE相關產品

5α-還原酶活性抑制的體外評估方法通常有紫外法、液相色譜-質譜（LC-MS）法、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法、放射性同位素法、熒光法等。其中LC-MS法、同位素法和ELISA法靈敏度高，均可準確測定5αR活性，但價格昂貴，對試驗人員操作技能要求較高；紫外法雖操作簡單，但測定的目標物NADPH對5αR并無專一性，易受到其他酶的干擾而造成檢測偏差。

鑒于此，IPHASE技術人員建立了一種基于可見分光光度法的5α-還原酶活性抑制效果體外評估的方法，該方法基于酶循環原理，提高了檢測靈敏度和特異性。該方法涉及兩步反應，首先5α-還原酶將睪酮代謝為5α-二氫睪酮，接著二氫睪酮在酶的作用下繼續反應，此反應過程中生成的產物在405nm波長處有特異性的峰值，通過檢測該產物在405nm波長處的吸光度變化，用來體現二氫睪酮生成的多少，最終反映5α-還原酶的活性變化，從而評估化合物的抑制效果（圖2）。由于檢測產物在405nm處有特異性的吸收峰，因此不受其他物質的吸光度的干擾，提高了檢測特異性。

圖2 基于可見分光光度法的5α-還原酶活性檢測原理

此外，為更好地滿足不同客戶的需求，IPHASE技術人員在此方法基礎上根據5α-還原酶的類型開發出Ⅰ型(SRD5A1)5α-還原酶抑制率評估試劑盒和Ⅱ型(SRD5A2)5α-還原酶抑制率評估試劑盒，可分別用于Ⅰ型5α-還原酶和Ⅱ型5α-還原酶抑制劑的篩選。

兩種試劑盒的不同主要體現在酶的來源和陽性藥物的選擇上，其中，Ⅰ型試劑盒為SD大鼠肝5α-還原酶和度他雄胺（Dutasteride），Ⅱ型試劑盒為SD大鼠睪丸5α-還原酶和非那雄胺（Finasteride）。此外，試劑盒還包括了睪酮T、NADPH溶液、酶制劑及反應緩沖液等成分，以確保用戶能夠輕松建立反應體系并進行檢測。試劑盒中各組成成分經過嚴格的質量檢測，試驗結果準確、可靠、重現性好。

IPHASE技術人員對陽性抑制劑非那雄胺的抑制效果進行評估，根據試劑盒說明書進行操作，試驗體系中非那雄胺終濃度為62.5ug/ml，睪酮終濃度為5uM，SD大鼠睪丸5α-還原酶終濃度為0.2mg/ml，第一步反應孵育時間為30min，第二步反應的孵育時間為4min。第二步反應后，用酶標儀檢測各組別在405nm處的的吸光度值：

按照下列公式進行抑制率的計算：

代入數值，可得出非那雄胺的抑制率為：

注：陽性對照樣本的抑制率在70%以上，試驗成立。

因此，在試驗初期，本試劑盒提供的方法可作為化合物高通量初篩的一種手段，簡便、高效，試驗結果準確、可靠。

關    于    我    們

匯智和源，致力于為創新藥研發企業及生命科學研究機構提供高品質的生物試劑，IPHASE為公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。