流式細(xì)胞術(shù)實驗操作步驟

流式細(xì)胞技術(shù)（Flow cytometry, FCM）是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種單細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)是單克隆抗體及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、激光和電子計算機科學(xué)等高度發(fā)展及綜合利用的高技術(shù)產(chǎn)物，它能有效地從單細(xì)胞水平區(qū)分異質(zhì)性細(xì)胞群體，檢測對象包括但不限于懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞或從實體組織分離的單細(xì)胞懸液和其他生物顆粒。

一、細(xì)胞表面染色步驟

1.細(xì)胞準(zhǔn)備：

1.1 采集全血或組織（脾，淋巴結(jié)，胸腺和骨髓等），用細(xì)胞染色buffer（或PBS）制成單細(xì)胞懸液。對于體外刺激的細(xì)胞，直接將刺激后的細(xì)胞懸浮在細(xì)胞染色buffer（或PBS）中，然后進(jìn)行第2步。

1.2 加滿細(xì)胞染色buffer（或PBS）, 1000 rpm 離心細(xì)胞懸液5分鐘，棄掉上清。

2. 紅細(xì)胞裂解：

2.1 如果需要裂解紅細(xì)胞（如脾臟），將10×紅細(xì)胞裂解液（RBC）用H2O稀釋到1×，放置到室溫。將細(xì)胞重懸于3 mL 1 × RBC中，室溫孵育5分鐘。

2.2 加入10 mL細(xì)胞染色buffer（或PBS）終止紅細(xì)胞裂解，1000 rpm離心細(xì)胞懸液5分鐘，棄掉上清。

2.3 重復(fù)洗滌一次，同步驟1.2。

2.4 細(xì)胞計數(shù)，用細(xì)胞染色buffer（或PBS）將細(xì)胞制成1×107 /mL懸液。將100 μL細(xì)胞懸液加入流式管中備用。

3. 封閉Fc受體：

        封閉Fc受體能減少染色過程中的非特異性染色。小鼠中，純化的CD16/CD32單抗能和FcγRⅢ/Ⅱ結(jié)合，封閉非特異性染色，可加入5-10 μg/mL的Anti-Mouse CD16/32單抗100 μL，冰上孵育10分鐘。對于人和大鼠，可直接使用過量的與熒光抗體相同來源和亞型不相關(guān)的純化Ig或者血清進(jìn)行阻斷。

4. 細(xì)胞染色：

4.1 按照說明書的推薦用量加入熒光標(biāo)記的抗體，混勻后置于冰上，避光孵育30分鐘。

4.2 加入5 mL FACs buffer (或PBS) 重懸細(xì)胞，1000 rpm離心細(xì)胞懸液5分鐘，棄掉上清。

4.3 加入0.5 mL FACs buffer(或PBS)重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測和分析。

注意事項

1. 在抗體使用之前，快速離心一下，使之聚集到管的底部。

2. 熒光標(biāo)記的抗體應(yīng)該避光4℃保存，不要冷凍。

3. 當(dāng)染色的時候，固定或延遲分析可能降低某些抗體的熒光信號。為了得到更好的結(jié)果，染色后應(yīng)該馬上分析。

二、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色步驟

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備：

1.1 收集細(xì)胞，用細(xì)胞染色buffer（或PBS）制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1 × 107/mL。

1.2  如需裂解紅細(xì)胞，將紅細(xì)胞裂解液(RBC)稀釋至1×，并平衡至室溫，用適量的1×紅細(xì)胞裂解液將細(xì)胞懸起，室溫避光孵育10分鐘；加入細(xì)胞染色buffer（或PBS）終止裂解，1000 rpm離心5分鐘，棄去上清。加入細(xì)胞染色buffer（或PBS）重復(fù)洗滌一次，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1 × 107/mL。

1.3 取100 μL細(xì)胞/管（約1 × 106細(xì)胞），分別加到已經(jīng)標(biāo)記好的流式管底部。

2. 固定：

2.1 如需要表面染色，則依照“細(xì)胞表面染色步驟”選用適宜抗體進(jìn)行表面染色。然后用稀釋至1×的細(xì)胞固定/破膜液（Fixation/Permeabilization buffer），將流式管中的細(xì)胞懸起，室溫避光孵育30分鐘。

2.2 1000 rpm離心5分鐘，棄去上清。

3. 破膜：

3.1 用稀釋至1×細(xì)胞破膜buffer將固定過的細(xì)胞懸起，1000 rpm離心力離心5分鐘，棄去上清。

3.2 重復(fù)洗一次，1000 rpm離心5分鐘，棄去上清。

3.3 加入1 mL 1×細(xì)胞破膜buffer，4℃避光孵育30分鐘；1000 rpm離心5分鐘，棄去上清。

4. 胞內(nèi)染色：

4.1 用100 μL 1×細(xì)胞破膜buffer重懸細(xì)胞，加入相應(yīng)的抗體，混勻，4℃避光孵育至少30分鐘。

4.2 加入2 mL 1×細(xì)胞破膜buffer懸起細(xì)胞，1000 rpm離心5分鐘，棄去上清。

4.3 加入2 mL細(xì)胞染色buffer（或PBS）懸起細(xì)胞，1000 rpm離心5分鐘，棄去上清。

4.4 加入0.5 mL細(xì)胞染色buffer（或PBS）重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測和分析。

注意事項

1. 同一個細(xì)胞同時做細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的蛋白，建議先做細(xì)胞表面染色，再固定、破膜。

2. 細(xì)胞內(nèi)染色推薦使用同型對照。

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