細(xì)胞鑒定是現(xiàn)代生物學(xué)研究的重要前提,因為從樣本中提取獨(dú)立的細(xì)胞組成部分十分必要,這樣才能進(jìn)行更加準(zhǔn)確的研究。原代細(xì)胞鑒定是指從活體組織中將原代細(xì)胞分離出來后進(jìn)行單元鑒定的一項技術(shù)領(lǐng)域。下面我們將詳細(xì)講解原代細(xì)胞鑒定的方法。進(jìn)行細(xì)胞分離后,必須及時進(jìn)行鑒定,確定細(xì)胞的純度和種類。在鑒定時,可以利用形態(tài)學(xué)、生化學(xué)方法或分子生物學(xué)技術(shù)方法等手段。
原代細(xì)胞的鑒定一般分為四類:形態(tài)學(xué)鑒定、免疫學(xué)鑒定、功能學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定四個方面。
形態(tài)學(xué)鑒定(基礎(chǔ)篩查):
一般是根據(jù)目的細(xì)胞相關(guān)特性在相差顯微鏡下觀察:觀察細(xì)胞形態(tài)、大小、排列方式及生長狀態(tài)。例如,神經(jīng)元:典型多極形態(tài),軸突/樹突延伸;肝細(xì)胞:多邊形/鋪路石樣排列,常見雙核;成纖維細(xì)胞:長梭形/紡錘狀,呈柵欄狀排列生長;內(nèi)皮細(xì)胞:蜂窩狀/鵝卵石樣鋪展,接觸抑制明顯等。掃描電鏡/透射電鏡:用于觀察細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)(如窗孔結(jié)構(gòu))或內(nèi)部結(jié)構(gòu)(如線粒體、細(xì)胞核等)。




免疫學(xué)鑒定(常用手段):
免疫熒光(Immunofluorescence,IF)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一種強(qiáng)大的技術(shù)。
它的原理是利用熒光標(biāo)記的抗體作為探針對組織或細(xì)胞內(nèi)的特定抗原進(jìn)行定位和定性的分析。IF是一個很好的檢測技術(shù)工具,用于研究感興趣的產(chǎn)物如分子、蛋白質(zhì)或糖蛋白的表達(dá)、定位、分布和遷移。
直接免疫熒光:
攜帶熒光素的抗體直接與抗原反應(yīng),形成抗原—熒光素標(biāo)記抗體復(fù)合物。該法優(yōu)點(diǎn)是較簡單,特異性較高;缺點(diǎn)是應(yīng)用范圍較窄,敏感性也較低。
間接免疫熒光:
先用特異性抗體與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)抗原結(jié)合,再用熒光素標(biāo)記的二抗與特異性抗體相結(jié)合,形成抗原-特異性抗體-標(biāo)記熒光抗體的復(fù)合物(實(shí)驗室*常用的方法)。
細(xì)胞免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗結(jié)合,其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識別并結(jié)合一抗,熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。

常用的標(biāo)記熒光素有異硫氰酸鹽(FITC)和四乙基羅丹明(RB200)等。前者最大發(fā)射熒光波長為525(490-619)nm,呈黃綠色熒光;后者最大發(fā)射熒光波長為595(540-660)nm,呈橙紅色熒光。我公鑒定一般用的綠光是FITC和488,紅光是CY3和594 。
▼大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞(100X)

▲β-Tubulin-Ⅲ

▲DAPI

▲Merge

▲白光
流式檢測(表征鑒定):
流式檢測是一種高效的單細(xì)胞分析/分選技術(shù),它能夠在細(xì)胞分子水平上通過單克隆抗體對單個細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析。流式細(xì)胞術(shù)的基本原理是使用熒光探針標(biāo)記待檢測的生物樣本,通過流式細(xì)胞儀檢測生物樣品上的被標(biāo)記的熒光信號來獲取相應(yīng)的生物學(xué)信息。其核心要素包括樣品的熒光標(biāo)記技術(shù)和流式細(xì)胞儀。通過檢測免疫細(xì)胞群的表面或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物,對流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定和表征。能夠精確鑒定和分類。例如,免疫細(xì)胞群:T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等。


功能學(xué)驗證(特性鑒定):
特異性功能檢測:例如,檢測神經(jīng)元的電生理活動、肝細(xì)胞的代謝功能(如糖原合成)、胰島細(xì)胞的胰島素分泌等。
細(xì)胞行為分析:通過細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗等評估細(xì)胞功能特性。
細(xì)胞顯色:
HE染色,顯示細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu),初步判斷細(xì)胞類型;
吉姆薩染色,用于觀察細(xì)胞核形態(tài)及染色體特征;
特殊染色,如油紅O染色(脂肪細(xì)胞)、PAS染色(糖原細(xì)胞)等。


分子生物學(xué)鑒定(基因分析):
基于基因表達(dá)的鑒定:
qPCR(實(shí)時熒光定量PCR):針對細(xì)胞特異性基因(如組織特異性轉(zhuǎn)錄因子、標(biāo)志蛋白基因)設(shè)計引物,通過檢測目標(biāo)基因的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)細(xì)胞類型區(qū)分。例如,利用Oct4/Sox2基因鑒定干細(xì)胞,GFAP基因鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞。
RNA-seq(轉(zhuǎn)錄組測序):通過全基因組轉(zhuǎn)錄本分析,比較樣本與已知細(xì)胞類型的基因表達(dá)譜相似性,適用于復(fù)雜樣本或未知細(xì)胞類型的鑒定。
基于DNA序列的鑒定:
STR分型(短串聯(lián)重復(fù)序列分析):檢測細(xì)胞基因組中特定STR位點(diǎn)的多態(tài)性,生成細(xì)胞特異性DNA指紋圖譜,用于排除交叉污染或驗證細(xì)胞來源。該方法被廣泛用于細(xì)胞系認(rèn)證,靈敏度可檢測低至1%的污染細(xì)胞。
SNP分型(單核苷酸多態(tài)性分析):通過分析細(xì)胞DNA中特定SNP位點(diǎn)的等位基因頻率,結(jié)合數(shù)據(jù)庫比對,輔助判斷細(xì)胞遺傳背景或種屬來源。
基于表觀遺傳特征的鑒定:
DNA甲基化譜分析:不同細(xì)胞類型具有獨(dú)*的DNA甲基化模式,通過全基因組甲基化測序(如WGBS)或靶向甲基化芯片,可區(qū)分細(xì)胞類型或發(fā)育階段。例如,神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的甲基化圖譜差異顯著。
組蛋白修飾檢測:利用ChIP-seq技術(shù)分析組蛋白修飾(如H3K4me3、H3K27me3)的分布,揭示細(xì)胞特異性基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),輔助鑒定細(xì)胞狀態(tài)。

總之,原代細(xì)胞鑒定是細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)工作,能夠為細(xì)胞和組織研究提供準(zhǔn)確的試驗條件,促進(jìn)我們對細(xì)胞學(xué)習(xí)的深入。在實(shí)際的實(shí)驗工作中,需要根據(jù)具體的實(shí)驗?zāi)康募澳康募?xì)胞特性來選擇合適的鑒定方法,嚴(yán)格遵守操作規(guī)范,并加強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)和純化工作,為獲得更可靠、有效的實(shí)驗數(shù)據(jù)提供有力保障。
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