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客戶(hù)成果分享 | 利用Micro-CT檢測(cè)小鼠樣本骨組織形態(tài)
浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院胡勁濤等教授在知網(wǎng)發(fā)布的《補(bǔ)充腎活躍血方對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松小鼠骨-血管形成偶聯(lián)調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究》，探討了補(bǔ)充腎活躍血方對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松小鼠骨量及骨代謝的影響。
實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了布魯克Micro-CT儀器，三維重建了小鼠的骨組織形態(tài)圖像。
引言
絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是絕經(jīng)女性的常見(jiàn)隱匿健康威脅，特征為骨量減、結(jié)構(gòu)退變，骨折風(fēng)險(xiǎn)大增。約半數(shù)絕經(jīng)女性患病，骨質(zhì)疏松性骨折率18%～23%，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。骨組織血管豐富，血管與骨形成緊密相關(guān)，絕經(jīng)后骨組織血管減少。腎虛血瘀型多見(jiàn)，補(bǔ)充腎活躍血方(基于右歸飲加桃仁、紅花)療效明顯。
本研究用補(bǔ)充腎活躍血方醫(yī)治去勢(shì)骨質(zhì)疏松小鼠，探討其對(duì)骨-血管形成及骨代謝的影響。
實(shí)驗(yàn)前瞻
一、實(shí)驗(yàn)儀器：
實(shí)驗(yàn)儀器JB-P5包埋機(jī)；RM2016病理切片機(jī)；Bruker Skyscan1272三維X射線(xiàn)顯微成像系統(tǒng)；E100光學(xué)顯微鏡。
Bruker Skyscan1272
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取50只4～5周齡SPF級(jí)健康雌性ICR小鼠,在室溫(24±2)℃、濕度40%～60%、12 h晝夜交替照明的環(huán)境下飼養(yǎng)。
三、動(dòng)物分組：
40只ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(10只)和去勢(shì)組(30只)。
四、造模：
去勢(shì)小鼠造模采用舒泰80 mg/kg腹腔注射麻醉及阿托品0.04 mg/kg肌注減少氣道分泌物。麻醉完成后剃除小鼠腹部毛發(fā)，予以聚維酮消毒3次后鋪無(wú)菌巾。取腹部正中切口，逐層切開(kāi)腹部肌肉及腹膜，沿輸卵管尋找到卵巢，摘除卵巢，縫合傷口。假手術(shù)模型行只切除卵巢周?chē)攘恐窘M織。
五、術(shù)后處理與分組：
去勢(shì)組小鼠行卵巢去勢(shì)手術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)8周，隨機(jī)抽取3只小鼠證實(shí)骨質(zhì)疏松造模成功后，隨機(jī)取20 只成模小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和中藥組，每組各10只。
六、給藥:
假手術(shù)組及模型組：等量生理鹽水灌胃。
中藥組：補(bǔ)充腎活躍血方按小鼠給藥劑量換算得小鼠含生藥劑量為8.6 mg/kg，每日灌胃1次。
七、樣本收集:
干預(yù)8周后處死，收集樣本。
八、實(shí)驗(yàn)開(kāi)展：
進(jìn)行Micro-CT、TRAP染色、免疫熒光染色( EM-CN、CD31) 、骨代謝指標(biāo)檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程
一、Micro-CT檢測(cè)骨組織形態(tài)
小鼠處死后，我們收集了股骨標(biāo)本，并仔細(xì)剔除了骨組織周?chē)募∪饧凹‰旖M織。接著，我們使用了Bruker Skyscan1272三維X射線(xiàn)顯微成像系統(tǒng)，按照設(shè)定的參數(shù)(電流140 μA、電壓70 keV、掃描厚度12 μm)對(duì)股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行了掃描。隨后，我們應(yīng)用了Bruker CTAn Micro-CT Software對(duì)骨組織形態(tài)進(jìn)行了分析，重點(diǎn)關(guān)注的指標(biāo)包括：骨體積百分比(BV/TV)、小梁數(shù)量(Tb.N)以及小梁厚度(Tb.Th)。
二、TRAP染色觀察破骨細(xì)胞數(shù)量
為了觀察破骨細(xì)胞的數(shù)量，我們對(duì)骨組織進(jìn)行了脫鈣包埋處理，并制成了4 μm厚的石蠟切片。接著，我們進(jìn)行了TRAP染色，并在顯微鏡下對(duì)破骨細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行了觀察。為了更精確地分析結(jié)果，我們采用了Image J軟件進(jìn)行了圖像分析。
三、免疫熒光染色觀察股骨遠(yuǎn)端干骺端CD31、EMCN陽(yáng)性表達(dá)
我們首先對(duì)石蠟切片進(jìn)行了脫蠟、抗原修復(fù)和封閉處理。然后，我們進(jìn)行了一抗(CD31、EMCN)的4 ℃孵育過(guò)夜。第二天，我們進(jìn)行了相應(yīng)的二抗孵育，并隨后采用了DAPI染液進(jìn)行染色。在熒光顯微鏡下，我們進(jìn)行了圖片采集，并再次采用了Image J軟件進(jìn)行了圖像分析。
四、骨代謝指標(biāo)檢測(cè)
為了檢測(cè)骨代謝指標(biāo)，我們收集了小鼠的腹主動(dòng)脈血液，并通過(guò)200g離心力離心5分鐘來(lái)收集血清。接著，我們應(yīng)用了ELISA法檢測(cè)了骨形成指標(biāo)I型前膠原氨基末端肽(PINP)和骨吸收指標(biāo)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
一、各組小鼠骨組織形態(tài)的比較
Micro-CT三維重建圖像顯示假手術(shù)組骨小梁較多，模型組骨小梁明顯減少，中藥組較模型組骨小梁增加。見(jiàn)圖1。定量分析結(jié)果顯示，假手術(shù)組骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)高于模型組和中藥組，而中藥組BV/TV、Tb.N、Tb.Th高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。
圖1 各組小鼠脛骨Micro-CT三維重建橫斷面
表1 各組小鼠Micro-CT檢測(cè)結(jié)果比較
二、各組小鼠骨組織破骨細(xì)胞數(shù)量的比較
骨組織TRAP染色及定量分析顯示，模型組TRAP陽(yáng)性表達(dá)的數(shù)目高于假手術(shù)組和中藥組，而假手術(shù)組TRAP陽(yáng)性表達(dá)的數(shù)目少于中藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2～圖3。
圖2 各組小鼠TRAP染色結(jié)果(×40)
圖3 各組小鼠破骨細(xì)胞定量分析比較
四、各組小鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端CD31、EMCN陽(yáng)性表達(dá)血管比較
應(yīng)用CD31、EMCN對(duì)股骨遠(yuǎn)端干骺端進(jìn)行熒光雙標(biāo)以檢測(cè)H血管的形成情況，結(jié)果顯示模型組干骺端H血管的比例相比假手術(shù)組明顯減少，中藥組干骺端H血管的比例較模型組增加，但低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示補(bǔ)充腎活躍血方可以促進(jìn)去勢(shì)骨質(zhì)疏松小鼠干骺端血管的形成。見(jiàn)圖4。
圖4 各組小鼠干骺端骨組織 CD31 + EMCN 陽(yáng)性面積比較
五、各組小鼠血清骨代謝指標(biāo)比較
表2 各組小鼠血清PINP、TRACP水平比較
結(jié)果
補(bǔ)充腎活躍血方可通過(guò)促進(jìn)骨-血管形成,增加骨生成,減少骨吸收,提高去勢(shì)骨質(zhì)疏松小鼠的骨量。
絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)的主要癥狀為腰背疼痛、骨畸形和乏力，中醫(yī)視其為“骨痿”“骨痹”，認(rèn)為與腎虛血瘀有關(guān)。女子絕經(jīng)后腎精虧虛，導(dǎo)致骨骼生長(zhǎng)維系受影響，形成腎虛血瘀的惡性循環(huán)。補(bǔ)充腎活躍血是醫(yī)治PMOP的重要原則，補(bǔ)充腎活躍血方通過(guò)補(bǔ)充腎健骨、活躍血祛瘀達(dá)到醫(yī)治效果，研究顯示它能增加去勢(shì)骨質(zhì)疏松小鼠的骨量和骨小梁數(shù)量及厚度。
近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)H型血管與骨生長(zhǎng)密切相關(guān)，H血管減少是PMOP的危險(xiǎn)因素。骨質(zhì)疏松女性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)水平較低，與骨形成指標(biāo)和骨密度正相關(guān)。促進(jìn)H血管形成可以抑制破骨細(xì)胞功能，增加骨形成，預(yù)防和醫(yī)治PMOP。
本文內(nèi)容來(lái)源：
https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=ifIT5_n5_GcV1J_62qIHt2mBULHLQLCH4IWu6b64IT-78Jz0V-qsV_jEX9rQg4MkMVNFmmiGcMSeGcofaLVoYoFta95NF_7dxzSaw4pKVV3dVneVV9Stp1xYCEFSyzqDMOJ88t1_3boQq7t4WlNQ0GlGIknHwpDg9FafXnFJjp8J1zw64PRwHODibLrhrDzgM_vj567UCeOt8rqmHfOypw==&uniplatform=NZKPT
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