簡介

蛋白質(zhì)組學工作流程在臨床診斷和生物技術行業(yè)中變得越來越重要，例如在治療藥物監(jiān)測或生物標志物檢測中。特別是基于液相色譜質(zhì)譜(LC-MS)的分析方法提供了同時檢測多種分析物的巨大優(yōu)勢(并且是定量的)。蛋白質(zhì)組學工作流程傳統(tǒng)上受到LC-MS檢測時間和樣品制備通量的限制。而LC-MS設備技術和工作流程的進步現(xiàn)在顯著增加了可以每周處理的樣本數(shù)量，瓶頸已經(jīng)轉(zhuǎn)向高效、穩(wěn)健、可靠的高通量樣本制備。在本應用中，我們演示了一種全自動高通量LC-MS樣品制備工作流程，將Hamilton液體處理技術與PreOmics iST工作流程相結合。

- 節(jié)省時間和成本，使96孔LC-MS樣品制備的無人值守時間增加

- 處理1-96個樣品具有靈活性，吸頭使用最少

- 標準化工作流程，具有高數(shù)據(jù)重復性和過程安全性

流程描述

自動化iST工作流程

在Hamilton液體處理平臺上處理96份樣本的試劑、實驗室器皿和模塊。每個步驟都會顯示設備上的溫度和運行時間。根據(jù)樣品材料的不同，溶解條件可能不同。消化后的肽重新溶解后，可將96孔板直接載入至LC-MS自動進樣器中。

應用軟件

操作員可通過圖形用戶界面定義每次運行的參數(shù)，例如LC-MS之前的消化時間或再增溶體積。

試劑盒描述

試劑盒包含使蛋白質(zhì)一步變性、還原和烷基化的專有試劑，以及進行胰蛋白酶消化的酶。最終肽純化包括兩個正壓96孔板(iST-REG-PSI 96HT(192個樣本): P.O. 00108; iST-REG-PSI 96HT(384個樣本): P.O. 00112)。

技術

LC-MS樣品制備實驗，如PreOmics iST試劑盒，在其工作流程中經(jīng)常使用有機和揮發(fā)性液體。Hamilton通道中的壓力系統(tǒng)允許通過例如抗懸滴技術(ADC)對此類液體進行可靠的監(jiān)測和控制。通道中集成的CO-RE（O型圈擠壓擴張）技術允許在不需要額外運輸工具的情況下，往返于臺面上的每個模塊。ODTC與Hamilton PCR Comfort蓋子相結合，可以高精度、均勻地控制蛋白質(zhì)消化過程中的溫度，不會因蒸發(fā)而導致液體損失。The [MPE]2提供了處理濾板的正壓功能和快速干燥樣品的蒸發(fā)器模塊，無需離心機。

結果

進行四項實驗以評估自動化工作流程的重復性和穩(wěn)定性：

(1) 用釀酒酵母蛋白提取物進行交叉污染實驗，表明有在[MPE]2正壓過程及流程中的任何其他步驟中沒有發(fā)生交叉污染。

(2) 在兩個不同日期消化來自畢赤酵母和商用人血漿的蛋白質(zhì)，并在獨立實驗中獲得數(shù)據(jù)。巴斯德畢赤酵母和人血漿中已識別蛋白的日間重疊率均達到100% 。

(3) 按照標準手動方案，消化等份的巴斯德酵母菌樣品。在手動日間運行中檢測到98%的已識別蛋白。

(4) 為檢測完整的96孔板自動化運行，處理了48份巴斯德畢赤酵母和48份商用人血漿蛋白提取物的等份試樣。獲得的標準化化蛋白強度表明，P. pastoris和人血漿的平均相關性分別為0.97和0.98 。

總結

驗證實驗和結果表明，PreOmics iST技術在Hamilton液體處理平臺上運行很有效。用戶可以通過自動化的標準化和可重復的工作流程，最終在不到4小時的總樣本處理時間內(nèi)得到LC-MS級多肽。酵母、人血漿和腦脊液(CSF) 樣本的成功處理(未顯示)證明了在臨床、生物技術和研究環(huán)境中的適用性。