細胞株開發（Cell Line Development, CLD）是生物藥物開發過程中一個極為關鍵也十分復雜的過程。一個優質的細胞株對于簡化CMC階段的開發流程和顯著減少藥物研發成本具有關鍵影響。為了闡明這一關鍵工作流程，BioPhorum的細胞株開發小組成員團隊制定開展了一項行業調研，調研結果以“When will we have a clone? An industry perspective on the typical CLD timeline“為題，發表在Biotechnology Progress期刊上。

這篇綜述為我們提供了深入的行業視角，探討了生物藥物細胞株開發（CLD）的復雜性，就CLD的挑戰和最佳實踐提供了寶貴的行業見解，旨在提高對生物治療藥物細胞株開發的理解和效率。盡管由于生物制劑開發平臺，不同公司的流程存在差異，但在關鍵工藝步驟中仍存在共性。

在調研中，布魯克的Beacon®單細胞光導系統被廣泛用于工業CLD實驗室，在單細胞克隆、克隆性確認和在過程早期識別高產細胞方面發揮著至關重要的作用，是該階段應用最多的技術手段之一。

綜述主要內容

調研覆蓋CLD以下三個主要階段針對性提出問題，共計341個問題：

1. 轉染前準備：包括載體設計和構建；

2. 轉染：涵蓋載體最初轉入細胞以及隨后的選擇和Pool的分析；

3. 單細胞克隆和先導克隆選擇：分離單細胞和確認克隆來源的方法、后續擴增和篩選過程以及識別和儲存最佳克隆的方法。

圖1. 針對CLD的三個不同階的調研方向描述

包括AbbVie、Bayer、GSK、Janssen、Merck&Co、Novo Nordisk、Pfizer、Takeda、BMS等27家大型制藥和CDMO公司參與調研（表1）。

表1. 參與調研的公司調研結果顯示出CLD過程的多樣性和共識，指出盡管不同公司采取了不同的方法，但大多數公司能夠在24至28周內完成從基因到主克隆的整個過程。這一時間跨度受到多種因素的影響，包括克隆選擇所需的數據量、所承擔的風險程度以及不同平臺方法的效率。作者指出，CLD的關鍵在于平衡速度與質量，確保在追求快速開發的同時，不犧牲細胞株的性能和穩定性。此外，結論部分也體現了行業內部合作的重要性，BioPhorum作為一個促進知識共享和最佳實踐發展的平臺，對推動行業發展起到了積極作用。

Beacon®平臺是單細胞克隆

和最佳克隆選擇階段的主要工具

單細胞克隆和最佳克隆篩選構成了細胞株開發（Cell Line Development, CLD）流程中兩個密不可分的環節，它們通過精細的小規模細胞培養技術和發酵工藝實現銜接。這一過程不僅耗時較長，且需要巨大的工作量，它涉及將眾多的單個細胞培養成為克隆群體，并通過一系列針對產量、增值速度和穩定性、產物質量等篩選流程，從數以千計的候選細胞中篩選出最佳細胞株。

調研結果顯示：所有參與調查的公司在開發抗體或復雜分子時都會進行單細胞克隆。這也是符合監管所要求的重組產品的細胞應從單一細胞祖先克隆而來。大多數受訪者在克隆之前或期間對轉染池進行特性化評估。在進行單細胞克隆時有幾種技術平臺可供選擇，其中38%的受訪者表示在CLD實驗室在單細胞克隆階段使用Beacon®平臺，是應用最多的技術路徑（圖2）。

圖2. 用于單細胞克隆的主要設備

在單克隆篩選階段，大約一半的受訪者每個分子篩選多達2000個孔，其余的受訪者篩選4000到10,000個孔，作者認為這些受訪者可能使用了Beacon®或者FACS等高通量的篩選方式。受訪者表示克隆效率存在較大差異，對于表達單克隆抗體的細胞株，克隆效率通常高于表達復雜分子的細胞株?？寺『蟮募毎枰诓煌呐囵B器皿中擴增，包括微孔板、試管旋轉培養器或搖瓶等。大多數受訪者在篩選克隆時主要考慮生長速度、產量和單克隆性，而較少在單細胞克隆階段篩選產品質量。

開發生產型細胞株的重要步驟之一是分離和擴增單個細胞祖先，并能夠展示高概率或能確保單克隆性。96% 的受訪者在單細胞分離的第0天和之后成長為細胞群體過程進行成像。所有受訪者對于復雜分子的成像方式相同，這表明這一步驟作為克隆性評估的一部分非常重要。許多受訪者不僅僅使用Beacon®進行單細胞克隆，還會用于成像以確?？寺⌒?，這讓Beacon®成為單克隆性確認成像儀器中使用最多的技術路徑（圖3）。

圖3. 用于單克隆性確認和細胞生長記錄的影像記錄設備

為了提高效率，大多數受訪者采用了自動化技術，包括單細胞、平板成像和擴增過程中的克隆挑選。大約三分之一的受訪者在研究細胞庫（RCB）建立前進行穩定性評估，而77%的受訪者在主克隆選擇前進行。

從單細胞克隆到最終克隆選擇的預期時間中位數為17-20周，這個時間包括了發酵評估、產品質量評估和研究細胞庫的準備。一些公司為了加速開發時間，可能會采取一些風險較高的做法，比如在RCB建立前不進行穩定性研究。

Beacon®系統在CLD領域的技術優勢

Beacon®單細胞光導系統自上市以來其CLD工作流程被諸多國內外大型制藥和CDMO企業采用。Beacon®能夠在短時間完成數千個單細胞的克隆、克隆性的確認以及基于產量、生長速度和產物質量的優質克隆篩選，加速藥物生產開發進程，為后續生產找到細胞株。

技術優勢

? 出色的單克隆性，獲得監管機構認可

? 更高篩選通量，找到稀有優質克隆

? 全自動實驗流程，顯著縮短細胞株開發周期

? 可靠的定量檢測，與生物反應器更好的相關性

? 兼顧細胞產率和產物質量，篩選高品質克隆

? 適用于各種類型生物制劑的細胞株開發