研究背景：

抗衰老藥物開發(fā)的一個主要挑戰(zhàn)是有效靶點的確定。表觀遺傳失調(diào)已成為衰老的關(guān)鍵標(biāo)志和驅(qū)動力，這表明改善這種失調(diào)可能是緩解衰老表型的一種有希望的策略。據(jù)報道，補充代謝物，包括NAD+前體，α-酮戊二酸鹽等，在一定程度上通過表觀遺傳調(diào)控表現(xiàn)出恢復(fù)青春的作用。然而，小分子化合物在代謝過程中靶向酶是否能夠通過代謝-表觀遺傳調(diào)控來緩解衰老表型，這在很大程度上仍然未知。

前期研究發(fā)現(xiàn)氯磺丙脲（chlorproamide, Chl）是磺脲類化合物，通過線粒體相關(guān)途徑對秀麗隱桿線蟲發(fā)揮抗衰老作用，然而Chl和磺酰脲類化合物的抗衰老作用靶點尚不清楚。

研究結(jié)果：

1、MDH2調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老

使用基于先前報道的靶向線粒體的抗衰老化合物（Chl）設(shè)計的化學(xué)探針（Chl- p），進(jìn)行了基于活性的蛋白質(zhì)譜分析（ABPP，由百泰派克提供），以發(fā)現(xiàn)磺脲類藥物的潛在抗衰老靶點（圖1a）。在通過原位Chl- p標(biāo)記和人胚胎肺成纖維細(xì)胞（MRC-5細(xì)胞）中10倍Chl競爭檢測到的蛋白質(zhì)中，MDH2成為一個潛在的靶標(biāo)（圖1a），因為它在線粒體代謝中的功能與之前報道的磺脲類藥物的抗衰老機制有關(guān)。

用免疫印跡法測定了阿霉素（Dox）誘導(dǎo)衰老的 MRC-5細(xì)胞（圖1b，c）和復(fù)制衰老的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEFs）（圖 1d，e）中 MDH2 的水平。結(jié)果顯示 MDH2 水平與細(xì)胞衰老呈正相關(guān)（圖1b-e）。MDH2敲除和過表達(dá)實驗結(jié)果證實，MDH2 可調(diào)控體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的衰老過程。

圖1 MDH2調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老

2、Gli抑制MDH2，延緩細(xì)胞衰老和小鼠衰老

為了測試磺酰脲類藥物對MDH2的影響，評估了重組MDH2在不同磺酰脲類藥物（包括Chl、Glibenclamide（Gli）、tolbutamine （Tolb）、gliclaide （Glic）和gllipizide (Glip)）處理下的活性。其中Gli對MDH2的抑制率最高，而Chl僅表現(xiàn)出微弱的抑制作用。為了驗證Gli和MDH2之間的相互作用，合成了一種化學(xué)探針（Gli- p）（圖2a）。在MRC-5細(xì)胞中，Gli- p對MDH2的原位標(biāo)記被8倍Gli顯著競爭（圖2b），表明Gli和MDH2之間存在直接相互作用。測定Gli與MDH2的結(jié)合常數(shù)（KD）為23.9 μM（圖2c），證實了Gli與MDH2的相互作用。Gli對衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色的緩解效果優(yōu)于Chl（圖2d，e）。

其他細(xì)胞實驗結(jié)果表明Gli延緩了Dox誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老和復(fù)制性衰老，減輕了細(xì)胞衰老過程中DNA損傷的積累。小鼠模型結(jié)果也證實了Gli作為MDH2抑制劑在體內(nèi)具有抗衰老作用。

圖2 Gli在體內(nèi)和體外均可緩解衰老表型

3、Gli緩解依賴于MDH2的細(xì)胞衰老

為了確定Gli緩解細(xì)胞衰老的作用是否依賴于MDH2，創(chuàng)建了MDH2敲低和過表達(dá)細(xì)胞模型，并測試Gli對衰老標(biāo)志物的影響。結(jié)果顯示，在敲低的細(xì)胞中，抵消了Chl和Gli的影響，而Gli比Chl更能減輕SA-β-gal染色。過表達(dá)的細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)Gli降低p16INK4a表達(dá)（圖3f，g）和SA-β-gal陽性（圖3h，i）的程度與陰性對照相同。這些結(jié)果表明Gli以MDH2依賴的方式延緩細(xì)胞衰老。

圖3 Gli緩解依賴于MDH2的細(xì)胞衰老

4、Gli通過抑制MDH2調(diào)節(jié)中樞碳代謝

之前的研究表明，Chl誘導(dǎo)復(fù)合體II衍生的線粒體活性氧（mtROS）。在Gli處理的細(xì)胞中，MitoSOXTM的熒光增加（圖4a），這與之前的報道一致。為了進(jìn)一步研究Gli或sh-MDH2對能量代謝的影響，檢測了亞細(xì)胞乳酸水平。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的乳酸水平升高（圖 4b），這表明 MDH2 抑制劑會導(dǎo)致TCA循環(huán)抑制，從而誘導(dǎo)有氧糖酵解。

在使用或不使用Gli處理的細(xì)胞（2 h）中進(jìn)行靶向代謝檢測，結(jié)果顯示，不同組間的代謝物主要涉及 “癌癥中樞碳代謝 ”和 “蛋白質(zhì)消化吸收 ”過程（圖 4c）。糖酵解中間產(chǎn)物被下調(diào)（圖 4d），而TCA循環(huán)中間產(chǎn)物（圖4e）和構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)的全部20種氨基酸（圖4f）被上調(diào)。處理24 h后，只有TCA 循環(huán)癌癥中的中心碳代謝中的代謝物富集（圖 4g）。糖酵解中間產(chǎn)物（圖 4h）和 18 種氨基酸（圖 4j）的水平得到恢復(fù)，而 TCA 循環(huán)中間產(chǎn)物的水平仍然上調(diào)（圖 4i）。這些結(jié)果證實了 Gli 直接靶向TCA循環(huán)并保持其代謝改變，而其他代謝途徑的改變在長期使用 Gli 治療中可以得到補償。

為了證實Gli通過抑制MDH2調(diào)控中心碳代謝，測定了Gli處理2小時后sh-Scr和sh-MDH2細(xì)胞中不同代謝物的含量。結(jié)果顯示，在Gli處理和sh-MDH2細(xì)胞中，MDH2催化的從蘋果酸到草酰乙酸的轉(zhuǎn)化被阻斷。Gli還下調(diào)了sh-Scr細(xì)胞中的氨基酸水平，而 sh-MDH2的作用被抵消了。這些結(jié)果表明，Gli 以依賴 MDH2 的方式調(diào)節(jié)碳代謝中心的代謝物。

圖4 Gli以TCA循環(huán)為目標(biāo)，調(diào)節(jié)中樞碳代謝

5、MDH2抑制調(diào)節(jié)SAH代謝和組蛋白甲基化

在依賴于MDH2的26種Gli調(diào)控的差異代謝物中（圖5d，橙色字體），補充S-腺苷高半胱氨酸（SAH）zuì xiǎn zhù地降低了p16INK4a的表達(dá)（圖 5e）。Gli處理后，細(xì)胞內(nèi)SAH水平下降，而S-腺苷甲硫氨酸（SAM）水平上升（圖5f）。這些結(jié)果表明，MDH2 抑制增強了蛋氨酸循環(huán)通量，該通量將SAH水解為高半胱氨酸，并以蛋氨酸為底物合成SAM（圖 5g）。在組蛋白甲基化位點中，Gli 在1天的處理中上調(diào)了H3K27me3水平，而H3K4me3和 H3K9me3水平未受影響（圖 5h，i）。在5天的處理中，H3K4和H3K27的三甲基化都增加了（圖 5j，k）。由于組蛋白甲基化對蛋氨酸代謝的動態(tài)很敏感，這些表型支持了在 MDH2 抑制下蛋氨酸循環(huán)通量的激活。

其他衰老細(xì)胞結(jié)果顯示，Gli上調(diào)了NRK-52E細(xì)胞中H3K4me3和H3K27me3的水平，而SAH只誘導(dǎo)了H3K4的三甲基化，這表明在MDH2抑制下，H3K27me3是甲基化的關(guān)鍵位點，可以延緩細(xì)胞衰老。

圖5 DA增加了UUO腎臟中p-β-catenin (S33/37/45/T41)，降低了總β-catenin含量

6、體內(nèi)抑制MDH2延緩肝臟衰老，上調(diào)H3K27me3

通過肝臟特異性敲低MDH2和Gli處理，檢測相關(guān)標(biāo)志物和組蛋白修飾。結(jié)果顯示，敲低MDH2或Gli處理均能顯著降低衰老小鼠肝臟中p16INK4a的表達(dá)水平，并上調(diào)H3K27me3水平。研究結(jié)果表明MDH2抑制（通過Gli或sh-Mdh2）干擾TCA循環(huán)，增強蛋氨酸循環(huán)通量，誘導(dǎo)H3K27me3的甲基化修飾，從而通過代謝-表觀遺傳調(diào)控減輕細(xì)胞衰老和組織衰老（圖7）。

圖6 抑制 MDH2 可延緩肝臟衰老并提高體內(nèi) H3K27me3 水平

圖7 抑制 MDH2 的代謝表觀遺傳調(diào)控抗衰老作用示意圖

研究結(jié)論：

研究介紹了一種通過靶向MDH2來緩解衰老表型的新方法，從而增強蛋氨酸循環(huán)通量并逆轉(zhuǎn)組蛋白甲基化的年齡相關(guān)改變。Gli作為MDH2的小分子抑制劑，是一種很有前景的先導(dǎo)化合物，可以通過修飾獲得最佳的MDH2抑制活性和藥代動力學(xué)性質(zhì)。基于Gli的衍生物可以更好地靶向MDH2，在通過代謝干預(yù)延緩衰老和減輕年齡相關(guān)疾病方面具有很大的治療潛力。

參考文獻(xiàn)：Mao, Z., Liu, W., Zou, R. et al. Glibenclamide targets MDH2 to relieve aging phenotypes through metabolism-regulated epigenetic modification. Sig Transduct Target Ther 10, 67 (2025).

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