脂質納米顆粒（LNPs）作為非病毒核酸遞送系統，在臨床應用中展現出巨大潛力。然而，LNPs的細胞內轉運機制，特別是其如何逃逸內體并釋放核酸貨物到細胞質中，仍不被充分闡明清楚。LNPs通常由可離子化脂質、輔助脂質（如DSPC）、膽固醇和聚乙二醇（PEG）脂質組成。膽固醇在LNPs中扮演多重角色，包括填補粒子間隙、限制LNP-蛋白相互作用和促進膜融合等。然而，膽固醇對LNPs細胞內轉運的影響尚未得到充分研究。本研究旨在探究脂質納米顆粒（LNPs）中膽固醇成分對其細胞內轉運效率的影響。通過開發一種基于鏈霉親和素-生物素-DNA復合物和高通量成像技術的高靈敏度LNP/核酸追蹤平臺，我們發現高膽固醇含量顯著阻礙了LNPs在細胞內的轉運，導致核酸貨物無法有效釋放到細胞質中，從而降低了遞送效率。這一發現為優化LNP配方以提高基因遞送效率提供了新的視角。實驗方法
抗體與試劑：包括兔抗EEA1抗體（早期內體標記物）、小鼠抗LAMP2抗體（晚期內體/溶酶體標記物）、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 555標記的羊抗兔和羊抗鼠二抗、DOPE-Atto647（用于脂質標記）、膽固醇、SM102脂質、DSPC脂質、mPEG-DMG脂質等。核酸材料：使用pUC57質粒作為模板，通過PCR擴增獲得約1000 bp的線性DNA，并在PCR過程中摻入生物素標記的dUTP，用于后續與鏈霉親和素-FITC復合物結合進行熒光標記。成像平臺：使用高內涵成像系統獲取細胞圖像，通過多層掃描（間隔1 µm）確保覆蓋細胞深度。成像時，可分別觀察脂質（DOPE-Atto647標記）、DNA（鏈霉親和素-FITC標記）以及特定細胞器（EEA1和LAMP2標記）的熒光信號。
實驗結果
2.1 LNPs重定向核酸細胞內轉運：
使用線性DNA作為模型核酸貨物，通過免疫熒光分析發現，LNP封裝顯著改變了核酸的細胞內轉運路徑。具體而言，與裸DNA相比，LNP/DNA復合物在細胞內呈現不同的分布模式。裸DNA主要滯留在早期內體中，其熒光信號與內體標記物EEA1共定位。而LNP/DNA復合物則在接種后迅速進入細胞，并在核周區域聚集，形成所謂的“溶酶體云”。這表明LNP封裝不僅促進了核酸的細胞攝取，還重定向了其細胞內轉運路徑，使其更接近釋放區域。Fig. 1. LNPs re-route nucleic acid intracellular trafficking.2.2 高膽固醇含量導致外周LNP-內體聚集：
通過設計一系列具有不同膽固醇含量的LNP配方，并觀察其在HeLa細胞中的分布，我們發現高膽固醇含量顯著影響了LNPs的細胞內轉運。具體而言，當膽固醇含量從基準處方的38.5%摩爾比增加到45%時，內體聚集現象明顯加劇；增加到50%時，形成大量微米級聚集體。隨著膽固醇含量的增加，外周LNP-內體的數量和大小均顯著增加。這些外周LNP-內體主要位于細胞核上方，且熒光信號強度隨膽固醇含量的增加而增強。進一步的分析表明，高膽固醇含量導致LNPs在細胞內的滯留時間延長，轉染效率顯著下降。這些結果表明，高膽固醇含量阻礙了LNPs向釋放區域的轉運，從而降低了核酸貨物的遞送效率。Fig. 2. Cholesterol aggravates formation and fusion of peripheral LNP-endosomes.2.3 DSPC緩解膽固醇誘導的外周LNP-內體聚集：
為了探究如何緩解膽固醇對LNPs細胞內轉運的阻礙作用，我們進一步研究了輔助脂質DSPC的影響。通過設計一系列具有不同DSPC含量的LNP配方，并觀察其在HeLa細胞中的分布，我們發現DSPC能夠顯著緩解膽固醇誘導的外周LNP-內體聚集。隨著DSPC濃度的增加（如從基準處方的10%摩爾比增加到20%、30%等），膽固醇誘導的內體形成得到顯著緩解。外周LNP-內體的數量和大小均有所減少，且LNPs的細胞內轉運和轉染效率得到提高。這些結果表明，DSPC作為輔助脂質，在LNPs的細胞內轉運中發揮了重要作用，能夠緩解膽固醇的負面效應。Fig. 3. DSPC alleviates formation of peripheral LNP-endosomes induced by cholesterol.討論
本研究新發現揭示了膽固醇對LNPs細胞內轉運的阻礙作用。高膽固醇含量導致外周LNP-內體聚集，阻礙了LNPs向釋放區域的轉運，從而降低了核酸貨物的遞送效率。DSPC作為輔助脂質，能夠緩解膽固醇的負面效應，提高LNPs的細胞內轉運和轉染效率。這些發現為優化LNP配方以提高基因遞送效率提供了新的策略。
結論
本研究表明，膽固醇是LNPs細胞內轉運的重要調節因子。通過優化LNP配方中的膽固醇和DSPC比例，可以提高LNPs的細胞內轉運效率和基因遞送效率。未來的研究應進一步探討膽固醇在LNPs中的作用機制，以及如何通過調整LNP配方來實現最佳遞送效率。
參考文獻：Luo, Chengzhi, et al. "Intracellular trafficking of lipid nanoparticles is hindered by cholesterol." International Journal of Pharmaceutics 671 (2025): 125240.
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