作者：Melanie R. Grably博士

編碼T型CaV離子通道的基因產(chǎn)生三個成孔亞基：CaV3.1、CaV3.2和CaV3.3，產(chǎn)生的電流在藥理學(xué)和電生理學(xué)上不同于高壓CaV1和CaV2通道電流。由于其重要的生理作用，以及與T型離子通道相關(guān)的通道病的數(shù)量不斷增加，對特異性和強(qiáng)效藥理學(xué)的需求正在上升。在這篇文章中，我們重點介紹了TTA-A2和TTA-P2的使用，這是阿洛蒙實驗室du家提供的兩種特異性強(qiáng)效T型離子通道阻滯劑。

簡介

T型CaV離子通道調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性、激素分泌和神經(jīng)遞質(zhì)釋放。它們還在晝夜節(jié)律周期、心血管和腎素-血管緊張素系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。

在小鼠中敲除CaV3.1、CaV3.2或CaV3.3離子通道可產(chǎn)生可行的表型，盡管每種表型都存在各種問題。與T型離子通道相關(guān)的通道病包括自閉癥、癲癇、高血壓、高醛固酮癥、慢性疼痛和shen經(jīng)病理性疼痛。由于其重要的生理作用，以及與通道相關(guān)的通道病越來越多，對特異性和強(qiáng)效藥理學(xué)的需求正在上升。

TTA-P2

TTA-P2是4-氨甲基-4-氟哌啶的衍生物，shou次被發(fā)現(xiàn)能有效、可逆地阻斷大鼠急性離體DRG的T型離子通道電流，IC50為100 nM，并能使T型離子通道穩(wěn)定在失活狀態(tài)。L型CaV離子通道和NaV通道對該化合物阻斷作用的敏感性要低100-1000倍。

TTA-P2(#T-155)被用來深入了解腎上腺小束細(xì)胞中表達(dá)的CaV離子通道的特殊作用和特性。事實上，TTA-P2抑制了細(xì)胞中表達(dá)的CaV3.2電流（圖1），并抑制了促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和血管緊張素II刺激的皮質(zhì)醇分泌。在缺氧條件下，腎上腺的兒茶酚胺分泌以BDNF/TrkB依賴的方式增加。用Alomone Labs抗TrkB（細(xì)胞外）抗體（#ANT-019）免疫組化染色顯示，TrkB受體在髓質(zhì)中高表達(dá)，其表達(dá)在缺氧條件下增加。除了兒茶酚胺分泌外，TrkB的激活還導(dǎo)致T型CaV電流引起的[Ca2+]增加，應(yīng)用TTA-P2可抑制這種增加，從而顯示了BDNF/TrkB信號傳導(dǎo)與T型電流之間的聯(lián)系。

圖1.TTA-P2對AZF細(xì)胞中對T型CaV離子通道有抑制作用。

A.牛腎上腺束帶（AZF）全細(xì)胞記錄。在用2 μM TTA-P2（#T-155）超滲細(xì)胞之前和之后，在10 mM Ba2+中記錄Ca2+電流對-5 mV電壓階躍的響應(yīng)，該電壓階躍是從-80 mV的保持電位開始施加的。

B.TTA-P2對CaV3.2電流的濃度依賴性抑制。括號內(nèi)為測定次數(shù)的平均值±SE。

經(jīng)美國生理學(xué)會許可，改編自參考文獻(xiàn)2。

疼痛的傳遞始于脊髓背角，然后由背角將信息傳遞出去。背角神經(jīng)元超極化后的興奮性去極化反跳是這些細(xì)胞的一個重要特征，TTA-P2的使用在一定程度上表征了這一特征。數(shù)據(jù)顯示，T型CaV離子通道及其電流的反跳性去極化和點燃對脊髓的軀體感覺信息整合非常重要。

丘腦在整合來自大腦皮層的輸入方面發(fā)揮著重要作用。一旦丘腦接收到這些輸入，就會將它們送回大腦皮層，形成皮質(zhì)-丘腦-皮質(zhì)環(huán)路。我們對這些突觸及其對高級腦功能的貢獻(xiàn)進(jìn)行了研究。桶狀皮層5B神經(jīng)元和后內(nèi)側(cè)核（POm）的神經(jīng)元被用來研究丘腦-皮層突觸的形成。利用條件性敲除GluA4、靶向CaV3.1通道的shRNA和T型特異性阻斷劑TTA-P2，數(shù)據(jù)顯示GluA4和CaV3.1控制L5-POm突觸傳遞的重要方面。

TTA-A2

TTA-A2是在鑒定T型特異性強(qiáng)效阻斷劑的過程中發(fā)現(xiàn)的。該化合物在轉(zhuǎn)染的HEK 293細(xì)胞和原生T型電流上進(jìn)行了表征。數(shù)據(jù)顯示，TTA-A2的IC50值為100 nM，與TTA-P2一樣，它優(yōu)先與處于非活性狀態(tài)的CaV3離子通道結(jié)合。TTA-A2對CaV3離子通道的選擇性為300倍。在體內(nèi)，TTA-A2能抑制野生型小鼠的主動喚醒并促進(jìn)慢波睡眠，但不能抑制缺乏CaV3.1和CaV3.34的小鼠。

血液中的氧含量由頸動脈體檢測。電壓門控Ca2+通道在檢測氧氣水平中發(fā)揮重要作用。CaV3.2離子通道是主要的T型CaV離子通道，表達(dá)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是感知氧氣的重要細(xì)胞。事實上，RT-PCR和使用抗CaV3.2 (CACNA1H)抗體（#ACC-025）的免疫組化顯示CaV3.2在大鼠頸動脈體中高表達(dá)。使用相同抗體對大鼠DRG裂解液進(jìn)行Western印跡分析表明，Ca2+離子通道也在DRG中表達(dá)。重要的是，對照肽抗原的使用wan全抹去了抗體獲得的信號。此外，研究發(fā)現(xiàn)CaV3.2參與介導(dǎo)頸動脈體對缺氧的反應(yīng)，應(yīng)用TTA-A2（#T-140）可抑制該反應(yīng)（圖2）。

圖2.TTA-A2抑制T型CaV離子通道對缺氧的反應(yīng)。

A.在載體或25 μM TTA-A2 (#T-140)存在下以及沖洗后5分鐘，感覺神經(jīng)對缺氧反應(yīng)（脈沖（imp）/s）的代表性示例。

B.TTA-A2對感覺神經(jīng)缺氧反應(yīng)的影響

經(jīng)美國生理學(xué)會許可，改編自參考文獻(xiàn)5。

在大鼠視網(wǎng)膜微循環(huán)的動脈血管中研究了T型離子通道在視網(wǎng)膜動脈血管肌源性反應(yīng)中的貢獻(xiàn)。使用Anti-CACNA1G (CaV3.1)抗體(#ACC-021)和Anti-CaV3.2 (#ACC-025)抗體對大鼠視網(wǎng)膜動脈血管進(jìn)行免疫組化染色顯示，雖然未檢測到CaV3.2，但在視網(wǎng)膜動脈平滑肌細(xì)胞的質(zhì)膜上觀察到強(qiáng)烈的CaV3.1染色。在血管周圍的膠質(zhì)細(xì)胞端足上檢測到CaV3.2。應(yīng)用TTA-A2或ML 218（#M-165）可擴(kuò)張離體的肌源性活性視網(wǎng)膜動脈血管，證明CaV3.1離子通道在動脈平滑肌細(xì)胞或視網(wǎng)膜動脈血管上有功能表達(dá)，并在肌源性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。

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參考文獻(xiàn)

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